耐酸血链球菌的构建与拮抗变异链球菌的作用机制研究

Streptococcus mutans (S. mutans) is one of the major cariogenic bacteria. Caries prevention is focus on killing S. mutans. However, the antibiotic resistance become a big problem. With the continuous development of the bioengineering, the researchers is interested in using probiotics replacement therapy. Bacterial replacement therapy is using harmless or low virulent strains, which preventing the colonization of specific pathogen, in order to achieve the purpose of prevention and treatment of disease. The candidate strains of caries replacement therapy is not only S. mutans but also Streptococcus sanguis (S. sanguis). This study is using DNA bioengineering techniques to construct the strains of the acidproof S. sanguis, and using the targeted peptides against Streptococcus mutans at the same time. In addition, study the antimicrobial activity of acidproof S. sanguis against S. mutans by PCR, scanning electron microscopy, laser confocal microscopy. The object of this application is therefore to explore the effects of replacement therapy in caries and clarify the relationship between S. mutans and S. sanguis. In addition, the aim of this application is investigating the mechanism of dental caries, invent the new treatment therapy and to improve the treatment of caries in clinic in microbiology.

变异链球菌是口腔主要的致龋菌之一。药物杀灭变异链球菌一直是龋病防治工作的重点，但细菌容易形成耐药性。随着生物工程的不断发展，运用益生菌替代疗法得到越来越多的关注。细菌替代疗法就是使用无害或者低毒力的菌株放入宿主的菌群中，防止特定病原体定植，从而起到预防、治疗疾病的目的。龋病替代疗法的候选菌种，除了变异链球菌本身外还有血链球菌。本研究通过DNA生物工程技术，构建耐酸血链球菌报告菌株，并同时使用靶向抗变异链球菌菌技术，通过PCR、扫描电镜、激光共聚焦等技术观察血链球菌报告菌株拮抗变异链球菌的能力。探索龋病替代疗法的作用效果和运用前景，并弄清血链球菌、变异链球菌在龋病发病过程中相互关系。为揭示龋病的发病机理提供基础，为探索更新治疗方法提供基础，并为提高临床龋病的治疗提供微生物学的基础。

龋病防治一直是口腔医学研究的重要部分。如何能够耐受酸性环境保持自身生长一直是临床抗龋的重要方向之一。随着生物工程的不断发展，运用益生菌替代疗法得到越来越多的关注。本研究采用培养基酸化培养构建耐酸血链球菌，并构建pleurocidin同源多肽pm11和靶向多肽，达到辅助拮抗变异链球菌的作用。.实验方法：通过培养基酸化培养构建血链球菌耐酸株，观察其生长情况，以及能否抵抗致死性ph 值的杀伤、存活率来测定适应性耐酸能力；通过平板实验了解血链和变链的竞争关系。通过实时定量PCR 检测相关耐酸基因的变化。设计同源多肽和靶向多肽，并检测了抗龋能力和抗菌机制的初步研究。扫描电子显微镜用于观察用同源多肽处理后的细菌膜，激光共聚焦用于观察对变异链球菌生物膜的杀菌作用，并检测其对人类牙龈成纤维细胞的毒性研究。.本研究发现（1）血链耐酸株在酸性环境和正常环境中生长都有明显优势；（2）血链耐酸株的Dnak、Groel蛋白明显增加，提示其与耐酸性的提高有一定关系；（3）血链耐酸株在ph值5.0的BHI平板实验中，仍能够很好的拮抗变链，显示其酸性环境下仍对变异链球菌具有拮抗作用；（4）构建的同源多肽Pm11为α螺旋结构，与设计预期相一致；（5）抗菌实验显示pm11具有广谱的杀菌作用，pm11在细菌细胞膜上形成小孔，导致细菌细胞膜破裂，细菌死亡；（6）靶向多肽C8gpm11具有一定的拮抗变异链球菌的作用，并能够与CHX起到协同抗菌能力，降低药物的使用量。.上述结果将为龋病的预防和治疗提供新的研究基础。