中药活性成分芫花醇A抑制Wnt信号通路的分子机制研究

Cancer is one of the most serious diseases in China. Large-scale genomic sequencing revealed frequent mutations of Wnt signaling pathway in major cancer types especially colon cancer, suggesting that it is a key target for cancer therapy. In previous work, we screened a Traditional Chinese Medicine library, and identified a candidate Wnt inhibitor Genkwanol A, an active compound isolated from Daphne genkwa Sieb. Wnt inhibition by Genkwanol A has been confirmed in Wnt3a and GSK3β inhibitor 6BIO treated 293FT cells, APC mutant SW480 cells, Apc deleted intestinal organoids, as well as Apc min/+ mice. Based on the previous findings, the project will focus on the mechanism study of Wnt inhibition of Genkwanol A, we will firstly identify the direct binding proteins using chemical proteomic approaches, and then evaluate the requirement of these proteins for Wnt inhibition via CRISPR/Cas9 technology. We will also comprehensively investigate the detailed mechanism of the interaction between Genkwanol A and the target proteins, and how the target proteins regulate Wnt signaling pathway. Our study is expected to not only promote the understanding of Traditional Chinese Medicine Daphne genkwa Sieb, but also allow further optimization of the compound for clinical use.

肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病之一，是我国居民的死亡原因之首。大规模基因组测序发现Wnt信号通路的突变与多种肿瘤尤其是大肠癌高度相关，提示该通路是关键的肿瘤治疗靶标。在前期筛选中药样品库的工作中，申报人发现并在多个细胞报告系统中证实中药芫花活性成分芫花醇A (Genkwanol A)对Wnt信号通路的抑制作用。重要的是，芫花醇A显著减少小鼠模型中Wnt通路依赖的肠道腺瘤。基于前期工作的结果，本项目聚焦芫花醇A抑制Wnt信号通路的分子机制研究，主要研究策略是首先通过化学蛋白组学方法鉴定芫花醇A的直接结合蛋白，然后利用基因删除技术鉴定其抑制Wnt通路的功能靶标蛋白，最后深入研究芫花醇A调控靶标蛋白的分子机制以及靶标蛋白调控Wnt信号通路的分子机制。本项目不仅能加深我们对中药芫花药理作用的理解，同时有望为基于芫花醇A开发中药创新药物提供理论依据，具有重要的科学意义和应用价值。

结肠癌是发病率和死亡率最高的癌症之一，Wnt/β-catenin信号通路是结肠癌公认的关键驱动因子，开发Wnt抑制剂有望为结肠癌靶向治疗提供候选药物。本项目负责人前期工作通过高通量筛选一个中药活性成分样品库，发现了具有Wnt/β-catenin信号通路抑制活性的LDA。本项目在验证了LDA抑制Wnt活性和抗肿瘤的基础上，进一步利用DARTS联用蛋白质谱（MS）技术鉴定了LDA的直接结合蛋白，利用微量热泳动（MST）技术验证了LDA与肿瘤坏死因子（TNF）受体相关因子2（TNF receptor-associated factor 2，TRAF2）的直接和特异性结合（Kd=6μM），并结合突变技术测定了LDA与TRAF2的直接结合位点是TRAF-C结构域。另外，本项目利用基因敲除和过表达实验，发现了TRAF2是个新型Wnt/β-catenin信号通路驱动因子和潜在的结肠癌治疗靶标， 并利用MST和免疫共沉淀技术证实了TRAF2与β-catenin在体外和活细胞内的直接结合，同时结合系列突变技术测定了TRAF2的TRAF-C结构域与β-catenin的N端结构域的直接结合，且这个结合可以被LDA所破坏。 最后，本项目利用TRAF2敲除细胞系，在细胞水平和动物水平证实了TRAF2是LDA抑制Wnt通路活性和结肠癌所必需的功能靶标。本项目不仅鉴定了新型Wnt抑制剂LDA的功能靶标蛋白TRAF2，而且发现了TRAF2是新型Wnt/β-catenin信号通路驱动因子和潜在结肠癌治疗靶标，具有重要的科学意义和临床转化价值。