Dkk-1与OPG/RANKL/RANK的"交互对话"调控牙移动破骨细胞分化的研究

破骨细胞产生的生理性骨吸收是正畸牙移动骨改建的必要前提和生物学基础。本课题组近期的Dkk-1转基因鼠研究提示：Dkk-1不仅能抑制Wnt信号通路的成骨效应，还能诱导破骨细胞的分化与激活，对颌骨的发育起重要的功能调节作用。本研究拟结合体内、体外实验，采用诱导、抑制策略，以Dkk-1与OPG/RANKL/RANK的"交互对话"为切入点，就其对牙移动破骨细胞分化的功能调控开展以下研究：①研究压应力对牙周膜成纤维细胞表达Wnt-3a、Dkk-1的影响；②采用Dkk-1质粒转染和抗Dkk-1中和抗体，探讨Dkk-1对前成骨细胞向成骨细胞分化及表达OPG、RANKL的影响；③建立大鼠牙移动模型，局部注射Dkk-1与抗Dkk-1抗体，探讨Dkk-1诱导移动牙压力区破骨细胞分化、发生区域性骨吸收的机制。本课题对进一步阐明牙移动破骨细胞骨改建的分子机理具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

目的：从组织形态、mRNA及蛋白水平研究Dkk1在正畸牙移动炎症反应中的功能调控作用。.方法与结果：1. 建立大鼠牙移动模型，按照加力天数分为7组：1， 3， 5， 7， 14， 21， 28天。以上颌切牙为支抗，使用镍钛螺旋弹簧对上颌左侧第一磨牙加载40g的力量，处死大鼠后进行相关分析。X线及Micro-CT显示加力后7-21天，移动牙压力侧牙周膜间隙变窄、BV/TV显著降低。HE染色显示压力侧牙槽骨有不同程度吸收。免疫组化显示压力侧Dkk1、TNF-α、RANKL表达明显，张力侧Wnt3a、Wnt5a、OPG、ALP、DMP1、OCN、DSPP、BSP表达明显。2. 利用Forcel四点弯曲体外细胞力学加载仪建立张/压应力（2000 μstrain，0.5 Hz）条件下MC3T3E1培养模型。RT-PCR显示在张应力刺激下成骨细胞Dkk1、TNF-α表达明显降低，Wnt3a、Wnt5a、ALP、Runx2、Osterix表达明显增加，同时茜素红、Von Kossa染色均较对照组增强。而压应力组上述各项指标刚好相反。3. 在张/压应力条件下建立了MC3T3E1细胞Dkk1过表达和沉默培养模型，发现Dkk1过表达组细胞增殖活性、成骨分化、矿化结节形成及各项成骨标志物表达均显著降低，β-catenin表达减弱，TNF-α表达增加；而Dkk1沉默组则相反。在此模型中加入外源性TNF-α细胞因子，细胞的增殖活性、成骨分化、矿化结节形成及各项成骨标志物表达在原有基础上显著下降，但Dkk-1沉默组加入TNF-α后各项指标与只加载应力刺激对照组差异无统计学意义，提示TNF-α在应力作用下抑制成骨细胞成骨分化的效应可能部分通过Dkk1介导。.结论：Dkk1是炎症反应因子TNF-α的下游因子，在牙移动产生的炎症反应中抑制成骨细胞活性及功能，增加破骨细胞增殖和活性，促进移动牙压力侧的骨吸收。