间日疟原虫GAMA蛋白在侵入Duffy阳性/阴性红细胞的功能研究及其免疫学分析

Plasmodium vivax is widely geographical malaria, and threatens almost 40% of the world’s population. P. vivax resists blood-stage infection results from absence of the Duffy (Fy) blood group at the surface of red blood cells (RBCs). Interestingly, resent studies from different malaria-endemic regions showed that P. vivax could infect Duffy-negative blood type people and cause clinical disease, suggesting that P. vivax may be involved into alternative erythrocyte invasion pathway(s). To well understand mechanism of P. vivax invasion, we are targeting PvGAMA which is the homologues of an important RBCs binding protein PfGAMA. Hence, we segmented PvGAMA, and expressed them by using wheat germ cell-free expression system. We clarified these proteins localization in parasite by immunofluorescence assay. We will analyze PvGAMA antigenicity and immunogenicity of these proteins, such as human sera response against antigens, serum titers, the percent of CD4+/ CD8+ positive immune cells, and Th1/ Th2 major cytokines levels of immunized mouse. Furthermore, Duffy +/- erythrocyte binding ability of these proteins will be tested that need to be expressed on the surface of COS-7 cell or HEK 293T cell incubating with erythrocytes. After binding assay, we term to screen the receptor(s) of PvGAMA from RBCs membrane using micro-array. Then protein-erythrocyte blocking assay of P. vivax will be processed using protein-specific antibodies. These results may explain the Duffy +/- erythrocyte infection by P. vivax parasite, and advance the development of P. vivax malaria vaccine as well.

疟疾是危害人类最严重的寄生虫病，而间日疟分布最为广泛，且防控难度大。PvDBP结合红细胞表面分子DARC曾被认为是间日疟原虫侵入红细胞的唯一途径。但最近发现Duffy阴性血型人群（DARC缺失）同样可感染间日疟，这提示间日疟原虫入侵红细胞可能存在PvDBP-DARC的替代途径。本项目前期发现：恶性疟原虫入侵红细胞关键的红细胞结合分子PfGAMA与其同源分子PvGAMA结构相似，表达位置相同，且同样具有结合一般红细胞的能力，因此PvGAMA很可能作为PvDBP-DARC的替代途径，在间日疟入侵Duffy阴性红细胞过程中发挥重要作用。因此，本项目拟通过检测PvGAMA与Duffy阳性/阴性两种红细胞的结合能力，并筛选出与之结合的红细胞膜表面结合受体，从而验证其作为PvDBP-DARC的替代途径的可能性。本研究将揭示间日疟原虫感染Duffy阴性红细胞相关分子机制，也可拓宽间日疟疫苗研新思路。

疟疾是严重危害人类健康和生命的重要传染病。对于疟疾疫苗的开发，如今存在两大策略：（1）减毒子孢子接种；（2）重组亚单位疫苗。研究证明间日疟原虫GPI锚定的微线体抗原（PvGAMA）可以与Duffy阳性和阴性血型的红细胞结合，其同源蛋白恶性疟原虫GPI锚定的微线体抗原（PfGAMA）也可以结合红细胞，并且其特异性抗体能够成功抑制恶性疟原虫对红细胞的侵入，但是在红细胞上的受体并没有被揭示。本研究将揭示恶性疟原虫、间日疟原虫侵入红细胞的机理为目标，阐明PvGAMA和PfGAMA结合红细胞的关键分子及其复合体的功能以及疟原虫的入侵机制，最终为完善间日疟和恶性疟疫苗研发策略提供理论基础。构建pET30a(+)-PvGAMA、PfGAMA质粒，并通过原核表达系统表达GAMA蛋白；提取人红细胞膜蛋白，通过串联亲和层析法筛选GAMA相关红细胞膜蛋白；质谱分析鉴定红细胞膜蛋白；体外构建并表达与GAMA结合的红细胞膜表面蛋白，通过体外pull-down法验证GAMA与人红细胞膜表面蛋白的相互作用；运用表面等离子共振技术（SPR）测试，以进一步验证蛋白相互作用及亲和力强弱；基于HuProtTM人蛋白质组芯片筛选PfGAMA Tr3的潜在结合分子。通过质谱分析鉴定出了与GAMA相互作用的人红细胞膜蛋白为ANK-1。Pull-down结果表明重组ANK-1蛋白与PvGAMA、PfGAMA结合的关键区域均为ANK-1 domain 2。SPR检测结果证实PvGAMA、PfGAMA与ANK1 domain 2相互作用，并且PvGAMA 与ANK-1 domain 2之间的相互作用比PfGAMA与ANK-1 domain 2之间的相互作用强。通过对芯片扫描图上的阳性点进行整理分析，得到89个潜在阳性蛋白。其中80%以上阳性蛋白与乳腺癌，结直肠癌，肺癌，前列腺癌等疾病相关。结论：本研究筛选出恶性疟原虫PfGAMA和间日疟原虫PvGAMA在红细胞上的特异性结合受体均为Ankyrin-1-D2, 揭示了GAMA蛋白在疟原虫入侵红细胞的重要功能，为完善恶性疟原虫和间日疟原虫的疫苗开发提供了理论依据，尤其是重组亚单位疫苗的开发。PfGAMA与肿瘤相关蛋白的相互作用提示，运用PfGAMA 标记肿瘤药物在靶向肿瘤组织的研究中具有潜在的应用价值，未来值得进一步深入研究。