糖原磷酸化酶表达模式改变与肝细胞癌生物学行为关系研究

糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP）是糖原代谢过程中限速酶，有肌型（PYGM）、肝型(PYGL)与脑型(PYGB)，三者分别特异性分布于肌肉、肝脏、大脑。研究发现PYGL是调节细胞坏死的重要分子，PYGB在鼠Morris 3924A和Novikoff 肝癌细胞系中表达明显增高，取代PYGL成为主要表达亚型，但在正常肝脏和Morris hepatoma 20表达极低或缺失。这种GP表达模式改变，即PYGL转变为PYGB，是否意味着肝细胞癌具有更加恶性的生物学行为（增殖快、分化程度低、侵袭性强），至今未见文献报道。本研究通过构建高低表达PYGB和PYGL的稳定细胞系，利用细胞增殖、侵袭、克隆形成、裸鼠成瘤等实验技术，研究PYGB和PYGL表达对肝癌细胞增殖、侵袭、成瘤能力等影响，结合临床组织标本检测与资料分析，阐明GP表达模式改变与肝细胞癌恶性生物学行为关系。

肝细胞癌是我国常见的高发的恶性肿瘤之一，临床上经常发现同一病理类型、同一分期、采用相同治疗方案的肝细胞癌患者预后完全不同。因此，寻找鉴定出能够辅助诊断或治疗的分子标志物对于我们认识和治疗肝癌具有十分重要的意义。糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP）是糖原代谢的限速酶，有肌型（PYGM）、肝型（PYGL）、脑型（PYGB）三种亚型。我们的研究发现在肝癌细胞系中，随着恶性程度的增加，PYGB的表达增高，而PYGL的表达降低。PYGB/PYGL表达的变化是否与肝癌的生物学行为有关？我们设计这一课题。我们构建了过表达PYGB和PYGL的质粒，建立过表达PYGB和PYGL的细胞系。通过细胞增殖实验、凋亡实验、细胞氧化应激实验、克隆形成实验、迁移实验及裸鼠皮下荷瘤等实验研究了PYGB和PYGL的生物学功能。研究发现，与PYGL相比，过表达PYGB细胞的增殖、抗氧化应激、克隆形成、细胞迁移、成瘤能力显著增强；NIH3T3细胞裸鼠皮下荷瘤实验，过表达PYGB组表现为实体肿瘤生成，而对照组未见肿瘤生长，这提示PYGB可能具有促进细胞恶性转化的功能。之后，我们又构建PYGB干扰病毒，研究发现干扰PYGB后，肿瘤细胞的增殖、抗凋亡、克隆形成、细胞迁移能力减弱。另一方面，我们用Western blot和PT-PCR方法研究临床肝癌组织样本的PYGL/PYGB的表达，结合临床资料，分析PYGB和PYGL与病理指标、生化指标、肿瘤大小、术后生存期等的相关性。结果示：109例肝癌临床样本PYGL mRNA和PYGB mRNA分析，PYGB和PYGL与临床样本的病理资料无相关性；96例肝癌样本的免疫组化结果统计分析，PYGB与血清甲胎蛋白（AFP）呈正相关（P=0.016），生存分析提示PYGB高表达的患者中位生存期和无瘤生存期分别为37.5个月(95%CI，29月-47 月) 和21个月(95%CI，12.8月-29.2 月)，而PYGB低表达的患者中位生存期和无瘤生存期分别为61个月(95%CI，48个月-74个月) 和41.3个月(95%CI，29.6个月-53个月)。PYGB高表达的肝癌患者总体生存率和无瘤生存率均明显低于PYGB低表达组（P =0.022， P=0.017）。而PYGL高低表达与患者预后无明显相关性。单因素回归分析结果显示：血清AFP值、HBs