下丘脑转录因子TTF1，EAP1，YY1和CUX1对Kiss1/GPR54的转录调控以及Kiss1基因转录的表观机制的研究

Kiss1/GPR54 system, which severs a major gatekeeper in controling GnRH release and activation of the mamalian reporductive axis, plays a pivotal role in the hypothalamic control of reproductive function. In fact, the expression of kiss1 and kiss1/GPR54 signal transduction could be affected by many factors. More rencently, it was reported that the KiSS1 promoter could be regulated by TTF1,YY1,CUX1 and EAP1 in luciferase reporter assays, but if these transcriptional regulators could control puberty and reproductive development through regulating the expression of kiss1 gene in vivo is unknown. Our study aims to find out the mechanisms of how these transcriptional regulators control the expression of kiss1 gene and the puberty and reproductive development through a loss-of-function approach, which using small interfering RNAs knocking down these regulators' expression in mice. Besides, we will use a high-throughput approach ( Microarray ) to figure out the gene network contributing to the hypothalamic control of puberty. Finally, we will focus on the potential contribution of epigenetics to the expression of kiss1 gene in the pubertal process.Taken together, our study is aimed at revealing the fundamental mechanism of some sexual abnormality diseases, such as precocious puberty, delayed puberty etc, and providing new insights into pathogenesis and treatment of these disease.

Kiss1/GPR54系统在HPG轴启动、GnRH释放中起着重要作用，是性发育正常启动的关键所在。Kiss1基因表达及GPR54受体相关信号传导受诸多因素调控，体外研究证实转录因子TTF1，EAP1，YY1和CUX1对Kiss1/GPR54基因的转录具有调控作用，但上述转录因子是否通过Kiss1/GPR54系统调控性发育尚未见报道。本课题拟利用上述转录因子的基因沉默型雌鼠探讨它们在不同的发育期对与性发育相关的kiss1/GPR54基因以及对整个青春期启动的调控作用；同时，利用基因组表达芯片技术从组学层面对青春期发育信号通路进行研究。我们还将从表观遗传学的角度进一步探讨青春期发育前后kiss1基因表达的分子机制。本研究将为性发育异常疾病如性早熟、青春延迟等的基础、临床研究奠定基础。

2003年发现的Kisspeptin/GPR54信号系统对性发育的调控作用，被认为是继1970年发现GnRH之后又一里程碑式的发现，编码Kisspeptin的KISS-1基因被认为在青春发育过程中起着“守门人”的作用，但其上游的调控机制却至今尚未阐明。直到2007年，研究人员利用高通量的基因芯片技术鉴定出KISS-1可能的上游调控基因，如CUX-1、TTF-1、YY-1、USF-2以及EAP-1等，在此基础上，本研究团队对CUX-1、EAP-1、TTF-1及YY-1与Kisspeptin/GPR54系统之间的调控关系进行了更为深入的研究。我们发现：1. EAP-1主要表达分布于下丘脑弓状核（ARC）区域，在性发育早期EAP-1蛋白的表达增加，提示其可能通过调控Kisspeptin/GPR54系统而参与青春发育启动的过程。2. CUX-1主要表达分布于下丘脑的ARC核团区域，在生长发育的各个阶段里都保持着比较恒定的高表达水平，可能发挥着其他某种重要的作用，并未参与性发育启动的过程。3. 我们进一步通过侧脑室注射慢病毒载体体内阻断EAP-1 mRNA的表达后，发现GnRH mRNA水平下降，阴门开启时间延迟，卵巢功能退化，但是KISS-1的表达无显著变化，提示EAP-1可能并非作用于KISS-1基因，而是通过直接调节GnRH神经元的表达或通过其他信号通路参与青春发育的调控过程。4. TTF-1和YY-1在ARC核团区域亦有表达，尤其是YY-1与KISS-1在下丘脑弓状核区域可共表达于同一神经细胞，同时YY-1 mRNA表达水平在性发育早期显著升高。5. 通过体外阻断YY-1 mRNA的表达后，我们发现EAP-1 mRNA水平亦下降，提示其可能通过调节EAP-1的表达参与性发育的调控过程。6. 2013年MKRN-3基因的突变被发现与家族性中枢性性早熟有关，因此我们新增测定了不同性发育阶段雌鼠ARC和前腹侧室旁核（AVPV）中MKRN-3启动子区域CpG岛的甲基化水平，结果显示其甲基化水平均较低，且青春期前后总甲基化率无显著差异。7. 青春发育前ARC和AVPV区域的KISS-1基因受检片段甲基化水平很高，总甲基化率分别为94.28%和90%。