脑肿瘤干细胞在胶质母细胞瘤中血管生成拟态现象的作用

我们前期工作发现血管拟态（VM）的胶质瘤细胞具有部分血管内皮的分子特征，如弱表达CD34，丢失GFAP。脑肿瘤干细胞（GSC）具有自我更新和多向分化的能力，故我们推测GSC是否可以分化为与亲本肿瘤形态和分子表型相似的并具有血管内皮特征的肿瘤细胞？进一步实验显示不是所有的胶质母细胞瘤中都能发现VM，表明不同个体GSCs不同分子遗传学特征可能起了重要的作用。本课题拟从胶质母细胞瘤手术标本中分离培养GSC，体内和体外模型筛选具有VM的GSC，对比GSC与非干细胞的胶质瘤细胞VM生成的差异；进行阵列比较基因组杂交(aCGH)和cDNA表达芯片检测GSC，分析其分子遗传学特征和VM的关系，选择候选基因进行基因水平上的干预，评价基因水平上干预GSC对VM生成的影响。旨在获得GSC分化为具有血管内皮特征的肿瘤细胞的证据，将阐明GSC不同分子遗传学特征与VM形成的机制，为以VM为靶点的治疗探索新路。

背景与目的：我们前期工作发现血管拟态（VM）的胶质瘤细胞具有部分血管内皮的分子特征，脑肿瘤干细胞（GSC）具有自我更新和多向分化的能力，故我们推测GSC是否可以分化为与亲本肿瘤形态和分子表型相似的并具有血管内皮特征的肿瘤细胞？进一步实验显示不是所有的胶质母细胞瘤中都能发现VM，表明不同个体GSC不同分子遗传学特征可能起了重要的作用。本课题拟从胶质母细胞瘤手术标本中分离培养GSC，体内和体外模型观察不同来源GSC的VM形成能力的差异；分析VM阳性及VM阴性GSC之间的分子遗传学特征和VM的关系，选择候选基因进行基因水平上的干预，评价基因水平上干预GSC对VM生成的影响。旨在获得GSC分化为具有血管内皮特征的肿瘤细胞的证据，将阐明GSC不同分子遗传学特征与VM形成的机制，为以VM为靶点的治疗探索新路。方法：收集手术切除GBM新鲜标本2例， GBM石蜡块标本48例，正常脑组织5例备用。采用CD34-PAS双染技术分析GBM的微循环构筑及其与正常脑组织之间的差异；采用“悬浮克隆球形成法”从新鲜GBM组织和GBM细胞株中诱导并鉴定GSC；体外三维培养模型及体内异种移植瘤模型分析不同来源GSC的VM形成情况；RT-PCR、免疫荧光及Western blot技术分析VM阳性及VM阴性的GSC之间的分子遗传学差异，确定调节VM形成的候选关键基因；慢病毒shRNA干预候选关键基因，RT-PCR及Western blot技术验证干预效果；肿瘤球形成试验及划痕试验、Transwell侵袭试验分析候选基因对GSC增殖和迁移、侵袭能力的影响；重复体内外VM形成试验及RT-PCR、免疫荧光及Western blot试验，分析验证候选关键基因对VM形成的调节能力及其相关细胞信号传导通路的变化情况。结果：GBM中存在血管内皮依赖性血管、肿瘤细胞依赖性管道、细胞外基质依赖性管道和马赛克血管4种微循环模式。GSC的VM现象可能与特定的分子遗传学背景有关。VEGF影响GSCs的侵袭、分化和管道塑型，促进GSC增殖、迁移和侵袭；GSC具有高度的可塑性，能在VEGF的诱导下向血管内皮细胞样细胞分化。VEGF在GSC的VM形成过程中起到了重要的调节作用。