PTB基因下调促人羊膜上皮细胞转分化为功能性运动神经元及其治疗SMA/ALS的研究

Human motor neuron differentiation of ES cells and iPS cells has forcefully prompted the study of the pathogenesis of SMA / ALS and other neurodegenerative diseases, and has built up our hopes to the treatment of these diseases. However the ethical problem and cancer-causing possibility greatly restricts the clinical use of the human motor neurons originated from these two sources. Human amniotic epithelia cells are easily obtained with strong ES cell-like stemness, low immunogenicity and no ethical issue. Recently, PTB gene knock-down was reported to facilitate the neuronal differentiation strongly. Current project aims to progressively trans-differentiate the amnion cells into functional motor neurons by the combination of the PTB down-regulation, which will succeeded by RNA interference method, and some small moleculars. The morphological characteristics, biochemical markers, and the integrity of the genome of the induced motor neurons will be identified. The in vivo and in vitro functions of these neurons, like synapses formation, muscle nerve innervation and electrical physiology characteristics, will be assessed. Furthermore, these motor neurons will be transplanted into the SMA / ALS mice models' spinal cords for the experimental treatments, and the therapy effects will be detected. Our goal is to establish a platform for the efficient induction of human amnion cells to trans-differentiate into functional motor neurons, to promote the promising motor neuron transplantation therapy aginst the SMA / ALS and the other neurodegenerative diseases clinically applying as soon as possible.

ES细胞及iPS细胞分化来的人运动神经元有力地推动了SMA/ALS等神经退行性疾病的机制研究，给治疗带来了希望。然而这两种来源的人运动神经元存在着伦理问题，致瘤性等致命缺陷，不适合临床应用。人羊膜上皮细胞具有较强的ES细胞样的干性，且无伦理问题，取材容易，低免疫原性。另据报道PTB基因下调可强有力地促进神经分化。本项目拟采用RNA干扰法下调人羊膜上皮细胞中PTB的表达，结合小分子化合物使人羊膜上皮细胞逐步转分化为功能性运动神经元。从形态特征，生化标记，基因组完整性等对得到的运动神经元进行鉴定，并分别从体内、体外对其突触形成，肌肉支配，电生理等功能进行评估，进一步将把得到的运动神经元移植到SMA/ALS疾病模型小鼠的脊髓进行实验性治疗，并从多方面对疗效进行检测。我们的目标是建立高效诱导人羊膜细胞转分化为功能性运动神经元的技术平台,让充满希望的运动神经元移植治疗早日走进临床。

SMA 和 ALS 是两种危及生命的中枢神经系统疾病，迄今没有很好的治疗方法，二者一个共同特征是运动神经元发生退行性病变。细胞移植给这两种疾病的治疗带来了新的希望，然而可供移植的细胞资源非常稀缺。人羊膜是胎儿分娩后的废弃物，人羊膜上皮细胞是羊膜最内层，紧靠胎儿的单层上皮细胞。人羊膜细胞具有一些胚胎干细胞的特征，且免疫源性极低, 可大量获得，无伦理问题。有报道移植人羊膜细胞有助于SMA 和 ALS的治疗，但这只是利用其旁分泌的支持作用，并不能逆转退变的运动神经元，达到治愈疾病的目标。如能够将人羊膜细胞诱导转分化为成熟的功能性运动神经元，以此来替代退变的运动神经元，这两种顽疾就有可能被治愈，这就是本课题的最终目标。为此目标我们设计了一系列的体内外试验，设法将将人羊膜细胞诱导转分化为成熟的功能性运动神经元。我们成功地分离了人羊膜细胞，建立了体外培养人羊膜细胞的方法。紧接着我们采用RNA干扰的办法将阻碍干细胞向神经系统细胞分化的PTB1基因下调，使人羊膜细胞具备了向神经系统分化的潜能。将PTB基因下调的 人羊膜细胞培养于神经细胞诱导分化培养液中可分化为神经细胞，将其培养于神经干细胞培养液可形成神经干细胞球样结构。将此球消化成单细胞先培养于运动神经元命运决定培养液，继而培养于轴突生长液中即可得到运动神经元样细胞。我们将有人羊膜细胞得到的运动神经元前体样细胞移植入小鼠体内，试图在体内分化得到运动神经元样细胞但没有成功。失败的原因是多方面的，一者可能我们体外得到的运动神经元前体样细胞和体内真正的运动神经元前体还有一定的差异，二者体内微环境非常复杂，我们必须设法创造一个适合人羊膜细胞衍生的运动神经元前体样细胞发育生长的环境。人羊膜细胞体内分化为成熟的功能性运动神经元体仍是我们努力的方向。