基于HIF-1a介导的VEGFmRNA、ANG/tie-2mRNA的表达探讨膈下逐瘀汤抗肝纤维化血管新生的分子机制

Angiogenesis has been recognised as a precursor of fibrosis in several pathologic conditions,existing studies have shown that inhibition of angiogenesis can effectively inhibit fibrosis formation. HIF-1α-mediated VEGFmRNA, Ang/Tie-2mRNA expression and angiogenesis of liver fibrosis has a very close relationship.Promoting blood circulation by removing Blood Stasis as an important treatment method of Traditional Chinese medicine,its anti-hepatic fibrosis has been confirmed by a large number of clinical studies.Drug for invigorating blood circulation and eliminating stasis can improve liver fibrosis induced angiogenesis, by what way is worthy of further study.Therefore, the selection of classic TCM prescription of anti-liver fibrosis - Gexiazhuyu decoction, by CCL4 rat liver fibrosis model, observed in rat liver fibrosis in the process of HIF-1α, VEGF, Ang/Tie-2 dynamic changes of gene expression and protein expression of VEGF and the effects of Gexiazhuyu decoction, and thus further elucidate the mechanism of action of traditional Chinese medicine against liver fibrosis angiogenesis, and provide a new therapeutic direction for Chinese medicine against liver fibrosis. Prescription to measure chinese medical syndrome to clarify the liver fibrosis "Blood Stasis" the new material basis for deepening the understanding of Chinese medicine liver fibrosis blood stasis and the pathogenesis of important theoretical value and practical significance of the guide clinical.

血管新生作用已经被公认是一些病理条件下肝纤维化的前奏，已有的研究表明，抑制血管新生能有效抑制纤维化的形成。HIF-1α介导的VEGFmRNA、Ang/Tie-2mRNA表达与肝纤维化血管新生有着非常密切的关系。活血化瘀作为中医学一种重要的治法, 其抗肝纤维化作用已被大量临床研究所证实，那么活血化瘀药物是否可以改善肝纤维化肝脏血管新生，通过怎样的途径是值得深入研究的问题。因此，本研究选用抗肝纤维化的中医经典方剂-膈下逐瘀汤，通过CCL4复制大鼠肝纤维化模型，观察大鼠肝纤维化形成过程中HIF-1α、VEGF、Ang/Tie-2基因表达及VEGF蛋白表达的动态变化及膈下逐瘀汤对其的影响，从而进一步阐明活血化瘀中药抗肝纤维化血管新生的作用机制，为中医药抗肝纤维化提供新的治疗方向。以方测证阐明肝纤维化"血瘀"证的新的物质基础，对深化中医肝纤维化"血瘀"病机的认识具有重要的理论价值和指导临床的现实意义

血管新生作用已经被公认是一些病理条件下肝纤维化的前奏，本研究选用CCL4复制大鼠肝纤维化模型，观察大鼠肝纤维化形成过程中与血管新生密切相关指标（HIF-1α、VEGF、Ang/Tie-2）表达的动态变化及膈下逐瘀汤对其的影响，从而进一步阐明活血化瘀中药抗肝纤维化新的作用机制，阐明肝纤维化“血瘀”证的新的物质基础。结果发现：① NAC、大剂量膈下逐瘀汤能有效抑制CCL4诱导的大鼠肝细胞外基质LN、Col-IV的表达；②NAC、大剂量和中剂量膈下逐瘀汤均能有效抑制CCL4诱导的大鼠肝组织HIF-1α 的高表达，与NAC相比，大剂量膈下逐瘀汤抑制HIF-1αmRNA表达的作用更稳定；在造模第6、9周，NAC和大剂量膈下逐瘀汤能有效抑制CCL4诱导的大鼠肝组织VEGF mRNA高表达；NAC与大剂量膈下逐瘀汤能够显著抑制CCL4诱导的大鼠肝脏Ang1 mRNA表达，其中膈下逐瘀汤具有显著的剂量依赖性；在造模第3周和第6周，NAC与大剂量膈下逐瘀汤能够显著抑制CCL4诱导的肝纤维化大鼠肝脏Ang2 mRNA表达，在造模第9周时，上述作用消失；膈下逐瘀汤与NAC对CCL4诱导大鼠肝组织Tie-2 mRNA高表达无明显的抑制作用。③CCL4慢性肝损伤显著升高大鼠肝组织VEGF、VEGFR2蛋白的表达，膈下逐瘀汤和NAC均能抑制CCL4肝纤维化大鼠肝组织VEGF、VEGFR2蛋白表达，其中膈下逐瘀汤大剂量组与NAC组效果相当，优于膈下逐瘀汤中剂量组，而小剂量膈下逐瘀汤上述作用不明显。随着造模时间的延长，NAC和大剂量膈下逐瘀汤均能稳定抑制CCL4肝纤维化大鼠肝组织VEGF蛋白表达；据此可以认为：①肝纤维化的“血瘀证”可能包含了与血管新生密切相关指标（VEGF、Ang/Tie-2）表达的变化；②HIF-1α可通过调控其下游基因VEGF、VEGFR2的高表达，促进肝脏炎症反应，增加肝组织纤维胶原和细胞外基质的沉积，介导肝窦缺氧应激损伤，参与肝纤维化的病理过程；③大剂量膈下逐瘀汤与NAC均可以通过调节Ang/Tie-2系统的表达来影响肝窦血管新生，减缓肝纤维化的进程；④大剂量膈下逐瘀汤与NAC均可以通过下调HIF-1α及其下游基因VEGF、VEGFR2的表达，减少肝脏纤维胶原和细胞外基质沉积，增强肝窦内皮细胞抗缺氧应激损伤和（或）促进肝窦内皮细胞修复、重建，阻断肝窦毛细血管化进程。