不可培养微生物中新铬还原酶基因的开发与应用

Nowadays, microbial heavy metal remediation is one of the hotspots in environmental protection field. Remediation efficiency and stress- resistance ability of microbial remediation genes are the critical factors of microbial remediation applications. Chromate reductases are enzymes that can reduce Cr(VI) into less toxic Cr(III). Known chromate reductases are all from culturable microbes and cannot function well in industrial wastewater. On the other side, non-culturable microbes account for more than 99% of total microbes. If we can utilize functional genes of non-culturable microbes, it will be a breakthrough in the field of microbial remediation of chromium. In this project, we will search for novel chromate reductase genes in non-culturable microbes from wastewater plant active sludge. Metagenomics library and transcriptomics libraries with or without Cr(VI) treatment will be constructed. Novel candidate genes for chromate reduction will be screened from the pool of upregulated genes under Cr(VI) treatment. Then we will synthesize full-length genes based on the metagenomics libraries. The function of these genes will be verified in Escherichia coli, and the working mechanisms will be explored via resolving the protein structures. Then these novel chromate reductase genes will be cloned into Deinococcus radiodurans R1 and the engineered bacteria will be applied to membrane bioreactor for evaluation of their abilities to reduce Cr(VI) in industrial wastewater. This project will also provide new insights for exploration of functional genes of non-culturable microbes.

微生物治理重金属是环保研究的热点。重金属修复基因是微生物治理的基础，基因的重金属修复效率与抗逆能力是应用的关键因素。铬还原酶可将高危害的六价铬还原成低危害的三价铬。已知的铬还原酶来自可培养微生物，在工业废水的逆境下不能很好的发挥作用。不可培养微生物占全部微生物的99%以上，如能对这部分微生物基因资源开发利用，将在微生物铬治理领域实现重要突破。本项目拟开发废水处理厂活性污泥中不可培养微生物的新六价铬还原酶基因。分别提取活性污泥微生物总DNA与RNA建立宏基因组文库以及六价铬处理前后的宏转录组文库。通过对比转录组数据，筛选出可能的新铬还原酶基因片段，然后参考宏基因组文库合成全长基因，在大肠杆菌中验证六价铬还原与抗逆能力，通过解析蛋白质结构来阐释机理。新基因将在抗辐射奇球菌中表达，这些工程菌株将运用于膜生物反应器，测试新酶处置含铬工业废水能力。本项目还将为开发不可培养微生物的功能基因提供新思路。

目前，微生物功能基因的研究基本都来自可培养微生物，而环境中未培养的微生物超99％，它们的基因资源尚未得到有效开发。在本项研究中，我们提出通过比较宏转录组学和宏基因组学来开发黄河兰州段西固工业区土壤微生物群落中来自未培养微生物的高效Cr(VI)修复基因。为了筛选新的高效Cr(VI)修复基因，对长期Cr(VI)污染河岸土壤进行了比较宏转录组和宏基因组的分析。根据高质量RNA产量和基因表达的倍数变化，确定Cr(VI)处理时间为30min。从不可培养的微生物中鉴定出6个在宏基因组文库中具有完整开放阅读框(orf)的新基因。在表型功能分析中，所有新基因均增强了大肠杆菌抗Cr(VI)/还原能力。在工业废水处理中，E-mcr和E-gsr在Cr(VI)浓度为200-600μM时，对Cr(VI)的去除率均不低于50%，且在17d内无明显降低。在600µM Cr(VI)压力下，E-mcr与E-gsr仍可以分别保持48.7％和62.2％的Cr(VI)去除效率，说明gsr和mcr在含Cr(VI)实际工业废水处理中具有很大的应用潜力。最后，对这两个基因进行Cr(VI)修复作用机理的初步探究。静息细胞试验表明，E-mcr与E-yieF的Cr(VI)修复能力类似。但在Cr价态分布分析中，E-mcr的胞外Cr(III)含量比E-yieF高40µM，并且透射电镜(TEM)显示细胞表面有大块黑色团聚物。因此，mcr被鉴定为膜上的铬还原酶基因，且很可能是通过呼吸途径还原Cr(VI)。静息细胞和酶活测试表明gsr没有Cr(VI)还原能力，但在不同的极端条件下(pH、温度、Cr(VI)、渗透压)，gsr使大肠杆菌的生长速率至少提高了30％，因此gsr被本研究中被鉴定为广谱压力应激基因。本研究为从不可培养微生物中研究新型高效污染修复基因提供了新的思路。