乙肝病毒X基因与生长抑制因子ING1剪接变异体在肝细胞癌发生中相互作用的分子机制

乙肝病毒X基因（HBx）与肝细胞癌（HCC）的发生有密切关系，但其具体的分子机制仍不清楚。我们前期研究提示生长抑制基因1（ING1）剪接体显著抑制肝癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，而且HBV感染影响ING1基因与p53基因间的协同抑癌功能。本课题拟建立可诱导表达全长HBx基因的肝癌细胞模型，通过基因共转染、流式细胞仪分析、免疫共沉淀、GST-pull down、激光共聚焦显微镜和功能基因组芯片等方法，探索HBx与ING1剪接体蛋白间的相互作用对HCC细胞生物学行为的影响，寻找或明确该作用在下游凋亡和细胞周期调控信号通路中的分子靶点；通过HBx定点缺失突变体确定HBx蛋白与ING1剪接体结合的具体区段；通过组织芯片和免疫组化方法分析HCC癌及癌旁组织中HBx与ING1蛋白表达间的关系。研究结果对阐述乙肝病毒感染相关性肝细胞癌的发生机制将具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

乙型肝炎病毒X基因（HBx）与肝细胞癌（HCC）的发生有密切关系，但其具体的分子机制仍不清楚。前期研究提示生长抑制基因1（ING1）剪接体显著抑制肝癌细胞的增殖、促进细胞凋亡，而且HBV感染影响ING1基因与P53基因间的协同抑癌功能。本课题建立了可诱导表达全长HBx基因的肝癌细胞模型，通过基因共转染、流式细胞仪分析、免疫共沉淀、GST-pull down、激光共聚焦显微镜和功能基因组芯片等方法，探索HBx与ING1剪接体蛋白间相互作用对HCC细胞生物学行为的影响；通过HBx定点缺失突变体确定HBx蛋白与ING1剪接体结合的具体区段；通过组织芯片和免疫组化方法分析HCC癌及癌旁组织中HBx与ING1蛋白表达间的关系。研究结果显示在HCC癌及癌旁组织中HBx蛋白与ING1蛋白及P53蛋白表达及细胞内定位均呈显著相关，HBx与ING1蛋白表达的核质移位有关系。与单转染ING1基因相比，共转染HBx基因与ING1基因使肝癌细胞HepG2增殖速度加快、细胞凋亡率减少、细胞周期进程加快，体外软琼脂克隆形成率增高，在裸鼠体内成瘤率明显加快。免疫共沉淀实验及GST-pull down实验显示HBx与p33ING1b剪接体蛋白间存在物理性结合，而且结合部位主要存在于细胞胞质中。激光共聚焦显微镜观察显示随着HBx逐渐在细胞质中表达增强，ING1b剪接体蛋白表达从细胞核中逐渐表达于细胞质中。通过HBx氨基端和羧基端及中间区段定点缺失片段与ING1蛋白结合实验分析，ING1b结合于HBx氨基端20aa－30aa区间，将该缺失突变的HBx质粒与ING1基因共转染后，与共转染全长HBx质粒相比，肝癌细胞凋亡率上升，下游基因Bax表达升高，Bcl-2基因表达下降，ING1b抑制细胞生长的功能部分恢复。观察HBx与ING1共转染相互作用后对细胞凋亡和细胞周期调控功能基因组芯片的表达变化，与假转染对照组比较，表达显著上调的基因有13条，表达显著下降的有14条，均与调控细胞凋亡和细胞周期进程密切相关。结论 乙肝病毒X基因与ING1基因剪接体相互结合，导致ING1核质移位，抑制肝癌细胞凋亡及加速细胞周期进程，参与肝细胞癌的发生。研究结果对阐述乙肝病毒相关性肝细胞癌的发生机制具有重要的理论意义和潜在的应用价值。