基于代谢组学研究柔嫩艾美耳球虫子孢子能量代谢途径

Higher organisms get their energy from tricarboxylic acid cycle for their survival, development and reproduction. Previous studies have shown that Pasteur effect is absent in apicomplexan parasites. In view of the differences in structure and mechanism of key enzymes between apicomplexan parasites and host, the key enzymes of energy metabolism have been considered as attractive drug target for chemotherapeutic intervention. But there is little progress in the research of new drugs, because of the metabolic pathways of energy production is still little known in apicomplexan parasites. Single-target-directed inhibitors of energy metabolic pathways exhibited less effect against coccidia infection in our previous research. This result indicated that E. tenella can obtain energy from different pathways. Therefore, this project intends to conduct a detail metabolomic analysis based on liquid chromatography tandem mass spectrometry for measurement of energy-related metabolites of E. tenella sporozoites. Metabolomics analysis is used to construct energy metabolic network and analysis metabolic nodes. The biochemical characterizations of metabolic nodes will be determined by modern biochemical techniques. Then, select multi-target-directed inhibitors against energy metabolic nodes and assess the anticoccidia activity of inhibitors in cell culture. The discovery and validation of drug targets provide essential information for drug research against coccidian.

高等生物主要通过三羧酸循环这一最有效的途径获得对其生存、发育及繁殖不可或缺的能量，研究显示顶复门原虫的能量代谢并不遵循"巴斯德效应"。由于顶复门原虫与宿主关键代谢酶在结构和作用机制上的差异，能量代谢途径关键酶作为抗原虫药物靶标成为了研究热点。但至今抗原虫新药的研发仍未取得突破性进展，最主要的原因是对顶复门原虫的能量获得途径尚不完全了解。本课题组前期研究发现，针对能量代谢途径单个关键酶的先导化合物不能抑制球虫的生长发育，暗示球虫能量代谢可能存在多种途径。本申请项目拟以柔嫩艾美耳球虫子孢子为研究对象，利用液相色谱-质谱串联技术分析其能量代谢相关的代谢物，运用代谢组学方法解析其能量代谢网络，分析能量代谢关键节点；运用现代生化技术分析靶标的生化特性，以关键节点为"组合靶标"筛选抑制物，并在细胞培养模型上评价抑制剂的抗球虫效果。阐明鸡球虫的能量代谢途径及其关键靶标，将为抗球虫药物研究提供理论基础。

研究显示与顶复门原虫（锥虫、弓形虫、隐孢子虫等）生存、发育及繁殖密切相关的能量代谢主要方式为糖酵解。由于顶复门原虫与宿主关键代谢酶在结构和作用机制上的差异，能量代谢途径关键酶作为抗原虫药物靶标成为了研究热点。本项目以柔嫩艾美耳球虫四个生活史阶段虫体为研究对象，利用液相色谱-质谱串联技术分析其代谢物并对数据进行 PCA、PLS-DA分析，发现将球虫子孢子与未孢子化卵囊对比，球虫子孢子的D-6磷酸葡萄糖、甘油醛-3-磷酸、D-甘露醇明显升高，D-山梨醇、乳糖、海藻糖降低，证实球虫存在糖酵解途径，部分六碳糖可作为能量底物；将饥饿处理子孢子与未饥饿处理虫体对比，处理后子孢子D-6磷酸葡萄糖水平降低，海藻糖显著升高，此外脂代谢相关代谢物含量显著增高，实验结果揭示子孢子在能量底物缺乏时，糖酵解途径代谢水平降低，而细胞膜脂类分解加快生成脂肪酸，脂肪酸利用β-氧化释放出能量供虫体利用。结合代谢组分析与鸡球虫基因组数据库信息，推测糖酵解为球虫的主要供能途径，其次脂代谢也可为特定条件下的球虫供能。此外，探讨了子孢子体外饥饿模型的能量底物利用情况，发现饥饿处理子孢子有效利用葡萄糖、甘露醇、脯氨酸、谷氨酸生成ATP，并利用葡萄糖、甘露醇、脯氨酸、果糖恢复其对宿主细胞的入侵活性，初步表明，E. tenella 的主要能量来源为葡萄糖，可以利用甘露醇，脯氨酸、谷氨酸、果糖等单糖分子。在前期研究基础上，运用生化分析方法解析主要能量代谢酶EtHK、EtGAPDH、EtG6-PI生化特性，并在酶动力学分析基础上，进行酶抑制动力学筛选到数个先导化合物；利用已建立稳定的E. tenella MDBK细胞培养模型，明确筛选到的小分子化合物Quercetin、Mangiferin能有效抑制球虫的生长发育，其MIC50分别为6.52和85.82 µM，进一步证实能量代谢主要酶EtHK和EtGAPDH是抗球虫药物筛选的潜在药靶。