RNA剪接因子Rbfox1和Mbnl2介导的NRXNs选择性剪接机制研究

Neurexins are a group of synaptic cell surface receptors playing important roles for the assembly of functional presynaptic terminals. The mutations in human neurexins have been discovered in patients with Autism Spectrum Disorders (ASD) and corresponding neurexin Neurexins are a group of synaptic cell surface receptors playing important roles for the assembly of functional presynaptic terminals. The mutations in human neurexins have been regarded as one of pathogenic mechanisms for Neurodevelopmental Disorders. Neurexins are extensively regulated by alternative splicing in neurons. Alternative splicing segment 4 (SS4) is currently known to be crucial for synaptic specification. But it is still not understood comprehensively how extensive alternative splicing of neurexins is regulated spatially and temporally in vivo for cell-type or functional specific synaptic differentiation. Rbfox1 and Mbnl2 are RNA splicing factors regulating alternative splicing of diverse neural specific genes. RNA seq and HITS-CLIP analysis of mRNA from Mbnl2 and Rbfox1 mice suggests interaction between these splicing factors and neurexin transcripts for alternative splicing of certain neurexin alternative exons. The goal of this project is to explore the possible alternative splicing mechanisms of neurexins that can complement with current known alternative splicing mode by further dissecting the interactions of A2BP1-neurexins and Mbnl2-neurexin in vitro and in vivo. We will also discuss the effects of non SS4 alternative splicing products on in vitro synaptogenesis. The observations from this project will be helpful to elucidate the mechanism of neural synaptic specification and functions.

Nrxns是一组在功能性突触前末梢组装中起重要作用的突触粘附分子，其基因突变导致的突触功能缺损被认为是神经发育障碍疾病致病机制之一。Nrxns被广泛选择性剪接调控，并且其剪接位点4与突触特化相关。但是人们对于各个位点的选择性剪接作用因子还不完全清楚，这也限制了对于选择性剪接时空特异性与神经突触形成特异性间相互关系的研究。RNA剪接因子Rbfox1，Mbnl2已被证实可以调控多种神经元特异因子的选择性剪接。对两种蛋白基因缺失小鼠的大脑RNA seq及HITS-CLIP分析表明Rbfox1和Mbnl2都存在Nrxns结合位点以及相应的选择性剪接产物。本项目拟在细胞培养体系及小鼠神经系统中深入分析Rbfox1和MBNL2与Nrxns mRNA的结合能力、剪接特性，以及剪接产物对突触诱导形成的作用，以探索Nrxns选择性剪接分子机制及其生物学作用。该研究将有助于阐明神经元突触形成与功能的特化调控机

突触是中枢神经元间相互连接并形成复杂环路进而构成神经网络的基础元件，突触的特异性与多样性是大脑进行各种复杂神经活动的必备条件之一。而突触的特异性与多样性可以通过RNA选择性剪接产物的多样性来实现。Nrxns是一组在突触前末梢组装中起重要作用的突触粘附分子，其基因突变导致的突触功能缺损被认为是神经发育障碍疾病致病机制之一。Nrxns被广泛选择性剪接调控，目前已知Nrxn家族成员有5-6个选择性剪接位点，不同选择性剪接组合可产生一至两千种蛋白质异构体，研究人员早先已预测这种RNA选择性剪接产物的多样性可能会导致相应蛋白质产物与配体结合的亲和力呈现时空上的多样性进而表现为神经功能的多样性。其中被研究得最详尽的就是SS4选择性剪接位点的剪除和保留在体外和体内的功能差异，但是长久以来关于其他非SS4选择性剪接位点的剪接机制和生物学意义却尚未有详细讨论。本研究试图填补这一研究领域空白。不同于之前我们的预测，虽然RNA剪接因子Rbfox1，Mbnl2可以对Nrxn3 SS4产生选择性剪接调控作用，但并未对非SS4位点产生显著选择性剪接效应，我们在研究中发现了另一个既可作用于SS4又可显著作用于SS3 的RNA剪接因子nSR100。在神经细胞与非神经细胞共培体系中我们发现对于α-Nrxn1, SS3, SS4 和SS6的剪除均可导致兴奋型突触后组分的募集，而对抑制型突触组分的募集没有影响；而β-Nrxn1，无论SS4存在与否都可促进突触后组分的募集。α与β选择性剪接产物在体外呈现的这种差异暗示非SS4位点与SS4位点对于突触特异性的调控可能存在明显的功能区分。近期研究还发现在EGR1-GFP转基因小鼠中长期恐惧记忆的获得可以激活海马DG区神经元，并且这种长期记忆的获得与Nrxn1的SS4保留形式的增加相关。有趣的是，我们对EGR1-GFP转基因小鼠进行青春期社交隔离后，被隔离小鼠也呈现出DG区神经元的异常激活。这种激活是否也与Nrxns的剪接形式被改变相关将是我们未来在这一研究中需要继续探讨的衍生问题。总而言之，我们的课题研究为探索RNA调控对哺乳动物中枢神经的高级活动的影响提供了从细胞水平至组织区域水平至行为水平多个层次的有益参考信息。