线粒体通透性转换孔开放在铅致神经毒性中的作用研究

Mitochondrial permeability transition pore (MPTP) plays an important role in the process of Alzheimer's disease, cerebral ischemia-reperfusion injury, etc. However, it is still not clear whether MPTP opening involves in lead (Pb) neurotoxicity. The major factors of MPTP opening induction are mitochondrial Ca2+ overload and oxidative stress, while Pb2+ could mimic Ca2+ and induce oxidative stress. This connection suggests that MPTP may involve in lead neurotoxicity. In addition, the previous results preliminarily observed that Pb could cause the opening of mitochondrial permeability transition pore, but the precise mechanism was unknown. Thus, this study aims to clarify the questions by using molecular biology methods. Firstly, the role of Cyclophilin D ( CypD) would be detected in the process of Pb-induced MPTP opening in SH-SY5Y cells. Then, the molecular mechanism of Pb-induced MPTP opening would be clarified. Finally, the study would investigate whether MPTP opening inhibition protects against Pb-induced oxidative stress, mitochondrial structure and function damage and cell death in vivo and in vitro. The completion of this study will help to clarify the mechanism of lead neurotoxicity and provide the scientific basis for MPTP as a potential target.

线粒体通透性转换孔（MPTP）在阿尔兹海默病、脑缺血再灌注损伤等疾病发生发展过程中扮演重要角色，但是其在铅致神经毒性中的作用仍不明确。研究表明MPTP开放的主要诱导因素为线粒体钙超载以及氧化应激，而Pb2+既可模拟Ca2+又能诱导产生氧化应激，二者间存在明显交集。前期研究结果发现铅可导致MPTP开放。根据以上证据，本研究提出MPTP的开放参与铅致神经毒性过程。本研究将采用分子生物学等方法，首先在SH-SY5Y细胞中阐明铅致MPTP开放的分子机制以及亲环素D（CypD）在其中的作用；然后在体内和体外研究中探讨抑制MPTP开放对铅致神经细胞氧化损伤、线粒体形态功能损伤以及细胞死亡是否具有保护作用。本研究的完成，将有助于阐明铅致神经毒性的分子机制，并为以MPTP作为潜在的干预位点提供科学依据。

铅（Lead，Pb）是一种常见的重金属污染物，可对人体多系统产生毒性，其中尤以神经毒性最受关注，但目前铅致神经毒性的分子机制仍未阐明。既往研究发现Pb2+可模拟Ca2+产生作用以及诱导产生氧化应激，而线粒体通透性转换（MPT）的主要诱因是线粒体钙超载以及氧化应激，故二者间存在明显交集。因此，本研究在体外研究中采用CRISPR基因编辑技术以及在体内研究中使用MPT抑制剂NIM811进行干预实验，发现：1、通过靶向CypD蛋白编码基因ppif，构建了ppif-/-SH-SY5Y细胞系，基因敲除并没有改变细胞形态，但会轻度促进细胞增殖，且敲除ppif基因可抑制铅致线粒体通透性转换孔（MPTP）开放和线粒体膜电位下降；2、ppif基因敲除可减轻铅致细胞线粒体肿胀破裂，并抑制线粒体过度分裂，降低p-Drp1/Drp1含量，还可抑制铅致自噬的发生，降低自噬相关蛋白ATG5、Beclin1、LC3Ⅱ水平，最终维持线粒体总量；3、ppif基因敲除抑制铅致Glut1和Glut3蛋白水平降低，并促进葡萄糖运输，还激活AMPK/Raptor信号通路，进而促进细胞能量代谢；4、ppif基因敲除减轻铅致线粒体氧化应激和细胞总氧化应激水平，提升还原型GSH含量和SOD酶活性，维持细胞抗氧化能力，还可抑制AIF的核转位，减轻铅致细胞核DNA损伤并降低p-H2AX蛋白含量，最终降低铅致细胞死亡，提高细胞存活率；5、在体内实验中，通过使用NIM811靶向抑制CypD，可减轻铅小鼠海马DG、CA1、CA3区和大脑皮层神经元死亡；6、NIM811减轻铅小鼠海马和大脑皮层氧化应激，并抑制SOD酶活性降低，维持神经细胞抗氧化能力。综上所述，本项目在体内体外研究中，分别采用药物处理和基因编辑技术抑制MPTP关键蛋白CypD，在细胞、亚细胞、分子水平研究CypD在铅致神经毒性中的作用，发现通过靶向CypD抑制MPTP开放具有显著的神经保护作用。本研究为进一步阐明铅致神经毒性提供了科学依据，同时提供了干预铅致神经毒性的新靶点，为防控铅致神经损伤提供了新的线索。