被子植物基部类群无被花三白草A和B类MADS-box基因表达、功能与进化的研究

Floral development has been studied quite extensively in higher eudicots. However, many important questions concerning the origin and evolution of flowers have remained largely unanswered. It is an important species of a perianthless Saururus chinensis in relation to understanding the origin and evolution of angiosperm flowers, due to its basal position in the angiosperms and unusual floral composition and petaloid bracts during flowering. Based on the four subtracted cDNA libraries from developing inflorescences and showy bracts,and compared expression profiles of inflorescences and different developmental petaloid bracts using cDNA microarrays, we have obtained up-regulated A, B-class MADS-box transcription factor homologues EST isolated from perianthless paleoherb S. chinensis，which control petal and stamen identity in floral organ of the higher eudicots. To further analyzed, we found that B-class MADS-box amine acid showed deletion from perianthless S. chinensis compared with genes from other basal angiosperm species. In the current project, methods of proteins interaction, gene expression, transgene will be performed and phylogenetic trees will be reconstructed.The interaction between the proteins which key amine acid sites showed deletion and petaloid bracts development will be studied in perianthless S.chinensis for the first time. The expression and functional evolution of A, B-class MADS-box transcription factors isolated from perianthless paleoherb Saururus chinensis and the absent perianth and petaloid bracts development will be explored. It is very important to correctly understand the origin and evolution of the perianth, and deep understand the origin and diversification of flowers in angiosperms.

花发育在高等植物中研究得比较多，但关于花的起源和演化过程还有许多问题有待于解决。无被花三白草在系统发育树中处于被子植物基部以及花结构的特殊性和开花时顶端苞片变成花瓣状，所以，三白草研究对于了解被子植物花的起源和演化具有重要意义。 申请者已经从三白草中构建了4个cDNA文库，用芯片分析方法筛选到上调的A和B类MADS-box EST片段，在高等真双子叶植物花器官中，这些基因主要控制花被发育。与被子植物基部类群中分离的基因相比较，从三白草中分离的B类基因有氨基酸缺失。 本项目进一步通过蛋白互作、基因表达、转基因和进化分析等方法，首次在三白草中对氨基酸位点发生缺失的蛋白进行互作以及花瓣状苞片进行研究。探索无被花三白草中A，B-class MADS-box基因的表达模式和功能演化以及花被的缺失和花瓣状苞片的发育，这对正确理解花被起源和演化过程以及深入了解花器官发育在进化过程中遗传变化具有重要意义。

通过用RACE在三白草花器官和瓣状状苞片中获得6个 A 和B class MADS-box 基因的cDNA全长。对其基因结构以及蛋白质C-末端结构域的比较，发现AP1-1转录因子与其它AP1蛋白C-末端具有不保守的结构域，AP3-A在K1 a-螺旋关键位点上发生氨基酸缺失,而AP3-B在K3 a-螺旋关键位点上发生氨基酸缺失，另外与其它AP3蛋白C-末端结构域比较，其具有PI和 paleoAP3 基序,PI无论编码的蛋白以及C末端的结构域与被子植物分离出来的氨基酸比较保守。进一步进行蛋白质互作验证，AP3自身不能形成同源二聚体，同时也不能与PI形成异源二聚体；PI之间能形成同源二聚体，同时用双荧光互补得到进一步的验证。.　　 用原位杂交对能够进行蛋白质互作的PI亚族MADS-box基因进行表达实验， PI-1基因在三白草花发育早期雄蕊和苞片表达，PI-B基因在三白草发育早期小苞片、雄蕊和心皮中上都有基因表达。用系统树对AP1, AP3和PI基因进行进化分析，无被花的三白草中分离出来的AP1-1，AP3-B， PI-A基因与来自于被子植物基部无被花的三白草科鱼腥草分离出来的基因具有很高的支持率;AP3-A基因与来自于被子植物基部无被花的楜掓AP3具有很高的支持率。对这些基因进行real-time PCR，这些基因在三白草花序和花瓣状苞片不同发育时期表达量比较高，其中AP1-2基因在白色花瓣状苞片中的表达量最高。.　　通过转基因方法对这些基因在拟南芥中进行功能验证，发现AP1-1基因能够促进拟南芥开花；AP3-A和PI-B基因的植株开花时柱头外露，在心皮中异常表达，与拟南芥中对应的同源基因相比较，获得在心皮中有异常表型的基因。.　　对AP1、AP3和PI基因进化分析，ω(dN/dS) 均小于1，说明基因在进化的过程中主要经历了纯化选择，产生功能不同的拷贝。.　　与被子植物中分离的基因相比较，从三白草中分离出来的氨基酸缺失AP3基因对蛋白互作造成影响，虽然在高等真双子叶植物花器官中，这些基因主要控制花被发育，在被子植物基部类群无被花三白草中虽然这些基因存在，但不能进行蛋白质互作，可能影响了花被的形成。通过对无被花三白草中A，B-class MADS-box基因的研究，这对正确理解花被起源和演化过程以及深入了解花器官发育在进化过程中遗传变化具有重要意义。