苹果炭疽叶枯病菌中一个叶枯致病因子候选基因簇的功能分析

There are two pathotypes of Colletotrichum pathogens on apple, ‘bitter rot’ type and ‘leaf spot’ type. The leaf spot type specifically causes Glomerella leaf spot disease. Based on the polyphyletic origin of ‘leaf spot pathotype’ species and their identical host specificity (being only pathogenic toward Golden Delicious cultivars), we postulate a host-selective pathogenicity factor determining pathotype differentiation. Via genomic and transcriptomic sequencing, we have identified a candidate pathogenicity-related gene cluster from C. fructicola (GLS-PGC1). The cluster has horizontal transfer characteristics and is unique to ‘leaf spot pathotype’ species; moreover, the cluster shows strong and specific expressional induction during Glomerella leaf spot pathogenesis. In this project, we would like to clarify the pathogenic functions of GLS-PGC1 via gene functional analysis; to analyze the chromosome karyotype pattern of C. fructicola and to analyze the chromosome localization of GLS-PGC1, so as to determine whether GLS-PGC1 and minichromosome are involved in pathotype differentiation. This study would lay a theoretical foundation for unraveling the pathogenicity mechanisms of Glomerella leaf spot pathogens and for unraveling the pathogenicity differentiation mechanisms of apple Colletotrichum pathogens.

苹果炭疽菌致病性有明显分化，表现为叶枯致病型和苦腐致病型，其中叶枯致病型可以引起炭疽叶枯病。根据病原菌多系起源特征及对金冠系品种的专一性致病特点，推断叶枯致病型由一个寄主选择性致病因子决定。前期研究中，我们通过基因组和转录组学分析，从果生炭疽菌中鉴定到一个在苹果叶片致病中特异性高表达，且有水平转移特征的叶枯致病因子候选基因簇。本项目拟通过基因功能分析验证该基因簇的致病功能，明确其在苹果叶片致病中的作用；拟通过果生炭疽菌染色体核型分析及该基因簇在染色体上的定位分析，明确该基因簇是否定位于小染色体、参与致病型分化。本研究对揭示苹果炭疽叶枯病菌的致病机理、以及苹果炭疽菌的致病性分化具有重要理论意义。

苹果炭疽叶枯病严重危害我国苹果生产，病原主要为果生炭疽菌。解析苹果炭疽叶枯病菌的致病机制和致病性进化可为作物抗病改良提供潜在靶标，对病害高效防控有重要理论指导意义。GLS-PGC1基因簇是前期鉴定到的一个在致病中特异高表达，且有水平转移特征的基因簇，推测与果生炭疽菌的致病型分化有关，是影响炭疽叶枯致病的关键因子。本项目结合基因组学、分子遗传学、分子生物学等手段开展研究，获得了GLS-PGC1基因簇的完整序列结构，明确了GLS-PGC1基因簇的群体分布特征，验证了GLS-PGC1基因簇的致病作用，分析了果生炭疽菌种内的小染色体多态性，明确了GLS-PGC1基因簇染色体定位的小染色体关联性，完成了预期目标。1）结合nanopore三代测序和Hi-C辅助组装，构建了果生炭疽菌的高精度基因组图谱，并进一步通过序列分析获得了完整的GLS-PGC1基因簇序列结构，证实基因簇包含至少4个重复性的区段，基因簇上基因存在多拷贝的冗余现象；2）在果生炭疽菌群体水平上证实了GLS-PGC1基因簇的炭疽叶枯致病菌株特异性，表明基因簇可作为病菌检测的特异分子标记；3）分析了基因簇上4个基因（SAL、Glu、GMC、Novel）的致病作用，证实4个基因均在致病过程中特异高表达，但基因沉默不影响炭疽叶枯致病性和毒力；4）基于脉冲场凝胶电泳分析，证实果生炭疽含有小染色体，菌株间小染色体数目和长度有多态性，但小染色体多态性与炭疽叶枯致病性无关联；5）结合脉冲场凝胶电泳和Southern杂交，证实基因簇在常染色体和非多态小染色体上均有分布。本项目解析了GLS-PGC1 基因簇的序列结构和致病作用，明晰了GLS-PGC1基因簇、小染色体、炭疽叶枯致病性三者间的关联特征，为深入揭示炭疽叶枯病菌致病机制奠定了基础。研究构建的果生炭疽菌高质量基因组图谱也为后续比较基因组学研究提供了重要资源参考。