东亚特有细茎石斛跨海分布的谱系地理学、保护遗传学及其种质鉴别研究

珍稀细茎石斛野生资源日趋匮乏，处于濒危状态，研究和保护其野生种质已成燃眉之急。本项目拟利用细茎石斛cpDNA、nDNA的分子标记，运用MrBayes或PAUP、DnaSP、Arlequin、Network、TCS等系列分析软件，构建系统发育树及单倍型网络图、确定古老单倍型及其分布地、和起源中心；阐述遗传漂变、瓶颈效应、自然选择等因素对细茎石斛群体遗传变异的影响，推测其冰期避难所、冰后期迁居路线、居群扩张时间，探讨细茎石斛在CJK地区跨海间断分布格局的成因，为其它东亚间断分布物种的相关研究提供参考。拟运用cpSSR、nDNA SSR以及AFLP等分子标记，进行细茎石斛的遗传多样性与遗传结构研究，开展遗传资源的评价和保护遗传学研究，提出合理的保护策略。还将筛选出具有居群种质鉴别意义的基因，应用于种质鉴别，为细茎石斛的GAP生产以及打击盗采行为提供理论依据。

运用荧光AFLP、SSR分子标记对珍稀细茎石斛野生居群的遗传多样性与遗传结构进行了研究。结果表明细茎石斛具有较高的物种遗传多样性，且居群内平均遗传多样性高于居群间平均遗传多样性。东亚细茎石斛居群被划分为3支，中国西南部，中国中部-东南部及CKJ岛屿区域。地理隔离 (IBD)的分析显示，在大范围内地理距离和遗传距离呈正相关，但在有些区域没有显著相关。BARRIER分析显示存在遗传障碍。提出云贵高原、 南岭山脉、大别山山脉等遗传多样性丰富的居群，作为应作为优先保护的野生居群。另外，还比较了野生和栽培细茎石斛居群的遗传多样性和遗传结构的差异，评价细茎石斛迁地保护的效果。.运用叶绿体、线粒体DNA片段以及核基因nrDNA ITS片段，分别构建细茎石斛cpDNA单倍型的Bayesian系统树和网状支系图。分析了古老单倍型，重建了居群间的亲缘关系，推测了细茎石斛居群的迁移路线，以及细茎石斛可能的冰期“避难所”，重建了细茎石斛发生的历史事件，为细茎石斛的物种分化与群体动态历史的研究提供了参考依据。研究表明：云贵高原和南岭山脉可能是细茎石斛的发源地，并通过南岭山脉向东向北迁移。日本、韩国居群叶绿体单倍型分化时间为上新世/更新世，说明在第四纪冰期前，细茎石斛已经在东亚广泛分布。mtDNA与cpDNA 的单倍型分布基本一致。. 基于细茎石斛等石斛属植物的叶绿体全基因组数据，运用串联、溯祖两种数据集整理的方法，重新对兰科各亚科间的系统发生关系进行了研究。认为兰科单蕊类群应该是单系类群，是由有含有1个雄蕊的祖先进化而来。研究揭示了树兰亚科34个属、杓兰亚科2个属以及兰亚科的3个属间的关系，支持Coelogyninae是树兰亚科最基底的亚族，恢复了Collabiinae和Dendrobiinae以前亚族的位置。.利用核LEAFY同源基因重建了中国石斛属植物的系统发生树，并且可以用于细茎石斛及其同属相似种的鉴别。我们还基于叶绿体基因组片段和real-time PCR技术成功鉴别了细茎石斛及其相似种药材，运用RADseq技术对细茎石斛野生居群进行了鉴定，取得了重现性极好的鉴别效果。对细茎石斛根、茎和叶中的内生细菌进行了分离鉴定，发现有4个促生潜力的菌株可作为促进细茎石斛生长的候选菌株。