ETFβ/ROS 在糖尿病肾病肾小管上皮细胞 EMT 中的作用及益气养阴活血通络法干预研究

Renal tubular injury is critical for the pathogenesis of diabetic nephropathy(DN). Epithelial to mesenchymal transition (EMT) mediated by ROS is considered to be an important mechanism of tubular injury in DN. Nevertheless, the origin of ROS in the kidney is unclear yet. In the previous study, we found that electron-transferring flavoprotein β subunit (ETFβ) mutated in OLETF rats by proteomics and over expression of ETFβ could reduce mRNA expression of NOX4, which lead to the production of ROS in the kidney. Consequently, we speculate that ROS originates from ETFβ mutation in the renal tubular may be important to EMT of diabetic nephropathy. The deficiency of QI and YIN with stasis is the main interpretation of DN. Tangshen Formula developed by Yi-qi Yang-yin and Huo-xue Tong-luo principle，which has the definite curative effect and alleviates pathological lesion and fibrosis in the renal tubular. In this study, we will justify the hypothesis that ETF participant in tubular EMT via production of excess ROS by gene transfection and siRNA both in vivo and in vitro experiments. Furthermore, the influence of Tangshen Formula on the biomarkers of EMT, ROS production, and the expression and activity of ETFβ is also to be analyzed. The study will reveal the mechanism of Tangshen Formula on alleviating pathological lesion and fibrosis in the renal tubular, and replenish the connotation of Yi-qi Yang-yin and Huo-xue Tong-luo principle.

肾小管损伤是糖尿病肾病（DN）发生发展的基础，大量活性氧簇（ROS）介导的肾小管上皮细胞间充质转分化（EMT）是DN肾小管损伤的关键环节。电子转移黄素蛋白β亚单位（ETFβ）可通过影响NADPH氧化酶和脂肪酸氧化途径参与ROS的产生。我们前期在差异蛋白质组学研究中发现自发性2型DN大鼠模型的ETFβ发生突变。因此，我们推测DN时ETFβ 异常是肾脏产生过量ROS，进而引起DN肾小管上皮细胞EMT的重要机制。针对DN的核心病机"气阴两虚夹瘀"，课题组研发了以益气养阴活血通络为治则的中药复方糖肾方，临床研究发现该药对DN有确切疗效同時基础实验证明其能显著改善肾小管病理损害及纤维化的作用。本研究拟采用基因转染、RNA干扰等技术，运用糖肾方从体内、外两方面验证ETFβ通过产生大量ROS参与DN肾小管上皮细胞 EMT发生的科学假说，同时阐明益气养阴活血通络法治疗DN抗肾小管间质纤维化的作用机制。

肾小管损伤是糖尿病肾病（DN）发生发展的基础，大量活性氧簇（ROS）介导的肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化（EMT）是 DN 肾小管损伤的重要机制，电子转移黄素蛋白β亚单位（ETFβ）是肾小管上皮细胞产生 ROS 的主要环节。课题组前期的差异蛋白质组学研究发现自发性 2 型 DN 大鼠模型的 ETFβ发生突变。因此，本项目主要研究了 ETFβ在 DN 发生发展中的作用机制。首先采用糖尿病肾病患者肾组织样本，以肾癌患者肾脏癌旁组织为对照，明确了ETFβ主要表达于肾小管上皮细胞，且在糖尿病肾病患者肾组织中表达下降。其次，我们用葡萄糖（Glu）刺激人肾小管上皮细胞 （HK2），利用RNA干扰和质粒转染技术在HK-2细胞中低表达以及过表达ETFβ,结果发现在高糖环境下ETFβ表达下降，低表达的ETFβ可能通过影响snail 1/2因子、TGF-β/smad信号通路和细胞氧化应激，促进了肾小管上皮细胞EMT，进而导致DN 肾小管损伤。另外，在棕榈酸刺激下低表达的ETFβ通过影响线粒体凋亡通路，促进肾小管上皮细胞的凋亡，而过表达 ETFβ能部分逆转线粒体凋亡通路相关指标的改变，降低脂毒性凋亡。这些研究说明了ETFβ参与了DN 肾小管损伤的EMT、凋亡等病理机制。益气养阴活血通络为治则的中药复方糖肾方可以显著降低自发性2型糖尿病db/db模型小鼠的尿白蛋白水平和肾脏细胞外基质沉积。与模型组比较，糖肾方处理可使ETFβ表达表现出一定程度上调，但是仍然没有达到统计学差异。这种结果可能与该模型肾小管病变不明显有关。因此，中药糖肾方能够明显改善糖尿病肾损伤，但是这种改善作用是否与ETFβ有关，还有待于进一步的探索。总之以上工作加深了我们对 DN 发病机制的认识，为防治提供了新的靶点。