猪早期胚胎发育组蛋白H4K12乙酰化位点变化及其表观遗传作用研究

Dynamic and complex changes of histone H4K12 acetylation in early development of embryos play important roles in cell reprogramming. However, because the number of embryos failed to meet the requirements of chromatin immunoprecipitation technology, H4K12 acetylation has not been studied at genome level. The invention of ULI-NChIP in 2015 provided technical support for the study of histone modification at the whole genome level. This project intends to adopt ULI-NChIP method to obtain the H4K12 acetylation map of GV oocytes of pigs and embryos 10h after parthenogenetic activation. Then the comparison of the specific changes of H4K12 acetylation between the two samples is going to be conducted in chromatin, different functional elements and the promoter of several candidate pluripotent genes. Finally, 3-5 differentially expressed genes are identified, and their important roles in early embryos are going to be verified through overexpression and suppression using interfering RNA (siRNA). From such a perspective of “high-low-high” of the H4K12 acetylation level changes from oocytes at GV stage to embryos 10h after parthenogenetic activation, the results of this project will reveal the epigenetic function of H4K12 acetylation by explaining the influence on chromatin structure and on the expression of critical genes. The results will provide a theoretical basis for further revealing of the molecular mechanism of reprogramming.

组蛋白H4K12乙酰化在卵母细胞及胚胎发育早期处于复杂的动态变化过程中，对细胞重编程发挥重要作用。但由于胚胎数量远不能达到常规染色质免疫共沉淀技术的要求，因此基因组水平的研究一直未能开展。2015年ULI-NChIP技术的发明为全基因组水平上研究组蛋白修饰提供了技术支持。本申请项目拟采用优化的ULI-NChIP方法，获得猪GV期卵母细胞及孤雌激活10h后胚胎的H4K12乙酰化图谱，并比较乙酰化位点在染色质、不同功能元件及候选多能性基因启动子区域中的变化。最终确定3-5个差异基因，并通过过表达与干扰RNA抑制表达，验证其在早期胚胎中的重要作用。本项目从猪卵母细胞经过减数分裂至早期胚胎过程中，组蛋白H4K12乙酰化水平发生“高-低-高”这一变化的角度着手，研究结果从组蛋白H4K12乙酰化影响染色质结构与关键基因表达两个方面揭示其重要的表观遗传学作用，为阐明重编程的分子机制提供理论依据。

卵子质量及早期胚胎是否发生完全重编程是正常妊娠及产仔的关键因素。组蛋白H4K12乙酰化在卵母细胞及胚胎发育早期处于复杂的动态变化过程中，对细胞重编程发挥重要作用。2015年ULI-NChIP技术的发明为全基因组水平上研究组蛋白修饰提供了技术支持。本项目首先采用免疫荧光的方法检测了猪及小鼠处于GV期的卵母细胞及孤雌激活10小时后的胚胎H4K12乙酰化（H4K12ac）情况，发现在猪和小鼠中变化趋势一致，均为GV期高修饰水平，进入GVBD、MI、MII后逐渐降低至不可检测，激活后，迅速重现。采用优化的ULI-NChIP方法，首次获得了猪GV期卵母细胞及孤雌激活10h后胚胎的H4K12ac修饰图谱，并比较了乙酰化位点在染色质、不同功能元件及候选多能性基因启动子区域中的变化。发现在猪GV期卵母细胞和早期胚胎中，H4K12ac具有分布更倾向于分布在基因上游和外显子区域。在孤雌激活这一“高-低-高”变化过程中，H4K12ac修饰的位点分布发生了很大的变化，几乎全部发生重排。有趣的是，我们发现与GV卵母细胞相比，孤雌胚胎中更多的H4K12ac富集到了基因的上下游，这可能与胚胎要发生重编程及合子基因组激活相关。我们对在卵母细胞和合子中上调的峰值相关基因进行了GO富集分析，生物过程主要富集到“细胞代谢过程”和“代谢过程”以及“催化活性”。最后，我们对早期胚胎中特异性的H4K12ac修饰位点对应的72个基因中，找到了Hjurp、Epb41l5、Pfkfb3、Cdk9、Cdan1、Ncoa6共6个候选基因进行了后续定量验证，发现了其中Epb41l5、Cdk9发生了上调表达，可能对后续的合子基因组激活有重要的作用。过表达Cdk9后，显著提高了孤雌激活效率。本项目结果从影响早期胚胎的染色质结构与影响关键基因表达两个方面揭示了组蛋白H4K12乙酰化在早期胚胎发育中的表观遗传作用，为阐明重编程过程的分子遗传机制提供理论依据。