高灵敏质谱探针技术研究RNA修饰在HIV/TM感染中的作用及其机制探索

Talaromyces marneffei (TM) infection is a high incidence of opportunistic infection among AIDS patients in southern China. It’s reported that RNA modifications regulate HIV gene expression and play an important role in opportunistic infection with AIDS. Our previous study found that RNA modifications may act on HIV/TM co-infection, however, the conventional method is not sensitive enough to detect RNA modifications. Hence, we aim to detect the modified nucleosides in peripheral blood mononuclear cells and urine of HIV/TM co-infected patients, HIV infected patients without TM, TM infected patients without HIV and healthy controls by using a new liquid chromatography-mass spectrometry method based on mass spectrometry probe technique. Furthermore, we will explore the regulation of differentially modified nucleosides on the HIV/TM co-infection both in vitro and vivo experiment, which will elucidate the role of modified nucleosides in HIV/TM co-infection. This project will provide new insight into the prevention and treatment of HIV-associated TM infection from the perspective of posttranscriptional modification.

马尔尼菲蓝状菌(Talaromyces marneffei, TM)感染是我国南方地区HIV感染人群高发的机会性感染。研究表明HIV感染造成的RNA修饰在调控HIV复制和艾滋病机会性感染发生中具有重要作用。我们前期研究发现RNA修饰可能作用于HIV/TM感染，但常规方法灵敏度不足。本项目在已建立的高灵敏质谱探针标记的基础上，进行外周血单核细胞及尿液中的RNA修饰全分析，以期全面揭示HIV/TM双感、HIV单感、TM单感和健康人群的RNA修饰情况，寻找人群间RNA修饰差异。再结合人群、体外实验考察差异修饰的RNA修饰相关酶对HIV/TM感染的调控，阐释RNA修饰在HIV/TM感染中的作用。本项目将从转录后修饰的新角度研究HIV人群易感TM机制及致病机理，为HIV/TM感染的防治研究提供新的思路和理论依据。

马尔尼菲蓝状菌 (Talaromyces marneffei, TM) 感染是HIV感染人群高发的机会性感染。目前已有研究主要集中在TM 入侵机制、感染后与宿主间的抵抗免疫学研究，但仍未能完全阐明HIV 人群中TM 感染宿主遗传学易感性和宿主与真菌抵抗性的关系，导致HIV合并TM感染的早期诊断和治疗方面仍存在困难。故本项目致力于利用高效液相色谱与质谱联用 (LC-MS) 等一系列技术研究HIV感染引起的RNA修饰变化并探讨变化的RNA修饰如何参与基因调控及其在HIV合并TM机会性感染中的作用机制。首先，本项目首先开发了基于2-溴-1-（4-二乙氨基-苯基）-乙酮为质谱探针的高灵敏的液相色谱-质谱分析方法（LC-MS）并应用于HIV-1感染细胞RNA 修饰中甲基化胞嘧啶核苷及其衍生物的分析。同时利用LC-MS方法在THP-1细胞感染HIV/TM的细胞模型中对m6A等RNA修饰进行了定性定量分析，发现THP-1细胞感染HIV-1后与正常组相比细胞内总体m6A显著性上升，TM单独感染和HIV/TM共感后m6A有上升趋势但不显著。说明HIV-1和TM感染在一定程度上与m6A相关，且单独感染与合并感染的情况存在差异，初步揭示了HIV/TM感染后m6A修饰的含量变化。接着，进一步通过m6A免疫共沉淀-高通量测序技术 (m6A-seq) 的检测对细胞模型中的不同感染情况下m6A修饰在不同基因上的分布及对基因表达的调控进行分析，通过分析发现m6A调控酶 YTHDC2在正常细胞、HIV感染、TM感染和HIV/TM共同感染的THP-1细胞中的表达存在显著差异。为研究其功能，通过慢病毒转染技术在THP-1细胞中敲降YTHDC2这一关键蛋白。敲降YTHDC2之后，明显抑制了HIV-1的复制以及TM的增值，并且显著上调Toll样受体2（TLR2）以及炎症因子TNF-α与IL1-β的表达。以上结果证明YTHDC2调控m6A 甲基化影响HIV 和TM 共感染宿主细胞天然免疫TLR2 信号通路并通过抑制TNF-α和IL1-β等炎症因子的表达从而促进HIV 和TM 的复制。综上，RNA修饰和YTHDC2可能可以作为一个新的靶点为HIV合并TM感染的治疗提供新的思路。本项目成果已发表中文1篇，协助培养2名硕士研究生和1名本科生毕业。