铜绿假单胞菌应答调节蛋白BfmR的动态磷酸化修饰及其发挥生物学效应的分子基础

Antibiotic resistance is one of the greatest challenges of the twenty-first century, and new drugs are urgently needed to combat diseases caused pathogenic bacteria such as Pseudomonas aeruginosa, which has become an important cause of gram-negative infection, especially in immunocompromised persons and in cystic fibrosis patients. Beyond its natural resistance to many drugs, its ability to form biofilm renders ineffective the clearance by immune defense systems and antibiotherapy. Researchers have identified response regulator BfmR required for the formation and development of biofilms. This discovery could lead to new ways of treating chronic infections. Previously, we found that BfmR is activated by phosphorylation on aspartic acid 55. In the proposed studies here, we will investigate the molecular biases for the dynamic phosphorylation and the biological functions of BfmR. The major goals of this proposal are to elucidate the pathway(s) that controls the dynamic phosphorylation of BfmR and to dessect the BfmR-mediated biological processes in the formation of biofilms, which may provide potential target for new therapies.

铜绿假单胞菌是一种重要的人类病原细菌，革兰阴性，它对多种抗生素表现为天然或获得性耐药。铜绿假单胞菌生物被膜的形成是导致其抗生素耐药、慢性感染以及感染反复发作的重要因素，临床治疗十分困难。2017年，世界卫生组织将对治疗耐药性铜绿假单胞菌感染药物的需求列为最高等级的“极为重要”级别。目前的研究表明，铜绿假单胞菌的应答调节蛋白BfmR对生物被膜的成熟起着非常重要的作用，是一个潜在的抗铜绿假单胞菌生物被膜感染（慢性感染）的药物作用靶点。在先前的研究中，我们发现BfmR蛋白上第55位天冬氨酸残基的磷酸化修饰激活了BfmR功能（PLOS Pathogens, 2014）。在本申请课题中，我们拟深入研究BfmR的动态磷酸化修饰及其调节生物被膜发育的分子基础。本项目的成功开展将深入阐明BfmR的作用分子机理，有助于为干预铜绿假单胞菌生物被膜的形成提供理论依据和新的切入点。

铜绿假单胞菌对多种抗生素表现为天然或获得性耐药，是引起囊性纤维化患者慢性肺部感染以及高死亡率的一种重要的病原菌。目前研究表明，铜绿假单胞菌的生物被膜形成是引起患者慢性感染以及反复感染的主要原因。.在本研究中，我们发现bfmS基因（编码双组分信号转导系统感应激酶BfmS）上自然发生的错义突变L181P/E376Q导致铜绿假单胞菌反应调节因子BfmR的磷酸化水平增高，从而激活了其转录调节功能。通过表型分析，我们发现L181P/E376Q突变使细菌群体感应系统的信号分子C4-HSL的产生减少，并且在果蝇和生菜感染模型中致病力下降而生物被膜的形成增多。机制研究表明，L181P/E376Q突变引起BfmS的磷酸酯酶活性降低，促使GtrS与BfmR形成功能性的双组分信号转导系统。除了L181P/E376Q错义突变，发生在bfmS上的其它错义突变如A42E/G347D、T242R以及R393H等均可引起类似的双组分系统的重塑。.通过染色体免疫共沉淀（ChIP）和高通量测序（seq）确定了在MPAO1基因组水平上，BfmR至少能结合在174个位点上。结合RNA-seq实验的结果，我们揭示了其中有172个基因是BfmR潜在靶基因。这些基因涉及到的生物学过程有：抗生素耐药性、生物被膜形成、群体感应系统以及金属稳态等。我们通过EMSA验证了BfmR与其中6个位点的结合情况，并通过DNase I足迹分析证实了这一结果。随后，我们证明了BfmR通过调节pboB的表达来调节细菌生物被膜的形成。.本研究阐明了自发突变介导的双组分系统的可塑性，并表明突变诱导的BfmRS 激活可能有助于铜绿假单胞菌在慢性感染期间对宿主的适应，为理解铜绿假单胞菌如何适应人体环境、引发人体疾病提供了新的视角，并为今后干预铜绿假单胞菌引起的慢性感染提供理论基础。