菠菜性染色体EST序列的快速克隆

性染色体演化分子机制的探讨对于研究新物种的形成、人类进化具有重要意义，是发育生物学研究的一个重要课题。各国学者以模式植物白麦瓶草为材料，对其性染色体演化进行研究，然而经过近10年，只克隆到不过10个性染色体连锁基因。如何快速高效克隆植物性染色体功能序列，从而更好地探讨性染色体演化模式呢？本项目以雌雄异株植物菠菜为材料，借助染色体显微分离技术对性染色体进行分离、标记，进行两轮DOP-PCR扩增。同时，利用RACE技术，获得菠菜雄花序cDNA。然后，性染色体扩增产物与cDNA进行杂交，借助杂交片段扩增技术进行扩增，从而获得性染色体上EST序列。最后，利用生物信息学手段对EST序列的功能进行分析。这一技术手段高效、快捷、经济、易控制，在性染色体演化模式研究中从未被使用过，本项目的成功开展将对性染染色体演化分子机制研究具有极大推动作用。

性染色体演化分子机制的探讨对于研究新物种的形成、人类进化具有重要意义，是发育生物学研究的一个重要课题。如何快速高效克隆植物性染色体功能序列，从而更好地探讨性染色体演化模式呢？本项目以雌雄异株植物菠菜为材料，借助45S rDNA-FISH技术，首次从细胞学水平证实菠菜最大染色体为性染色体。然后，利用染色体显微分离技术对菠菜性染色体进行了显微分离、鉴定，成功获得Y染色体DOP-PCR扩增产物，并进行了染色体涂染验证。将菠菜Y染色体DOP-PCR扩增产物与菠菜雄花序cDNA进行杂交，菠菜雌性基因组作为封阻，我们建立了快速克隆菠菜Y染色体特异EST序列的技术体系。目前，成功测序100个克隆，获得90个序列，其中最长的片段长394 bp，最短片段为55 bp。对获得的EST序列进行了同源序列比对，并用Blast2go软件对序列进行了生物信息学分析。此外，采用抑制性消减杂交（SSH）技术构建了菠菜雄花SSH文库，对雄性花芽组织差异表达基因进行筛选。通过克隆、斑点杂交验证，测序并获得EST序列196条。片段大小分布于100～1 000 bp，多数集中在300～500 bp。序列总长45 723 bp，最长序列片段大小为957 bp，最短序列片段大小为122 bp，平均大小234 bp。在NCBI网站上，利用Blastx软件对EST库进行搜索，全部都可以搜索到来自于其它物种中的相似EST序列。其相似序列大多来源于杨树、山茶、松树、甘蔗、牵牛花和百合花等物种。使用Blast2GO软件，对GeneBank 中无冗余蛋白序列库中搜索，有85条可以检测到相似序列，占总EST序列的39%。经过基因注释分析（GO），按其处于的生物功能通路进行分析，主要分布于ATP结合、核糖体生物合成、RNA加工、复制后修复、蛋白质磷酸化等方面。按其生物功能分析，主要功能为蛋白激酶、转移酶、RNA 3’磷酸环化酶、 氨基酸连接酶、UBC13-MMS2复合体。在本项目的资助下，共在国内核心期刊上发表论文4篇，SCI期刊上发表论文6篇，培养硕士研究生5名。