SIAH2抑制PEG10泛素化降解并影响肝癌生长和侵袭转移的分子机制研究

酵母双杂交和GST实验证实：E3泛素连接酶SIAH2与肝癌发病特异性基因PEG10之间存在蛋白质相互作用，具体机制尚不明确。本研究在临床切除的肝癌和相应癌旁组织标本中分析SIAH2和肝癌临床病理特征及预后的关系；采用RNA干扰技术下调HepG2中SIAH2的表达，RT-PCR、Western blot、MTT、Transwell、流式及细胞克隆形成实验分析PEG10表达水平和细胞增殖、侵袭能力的变化。在293T细胞内共转染SIAH2和PEG10表达载体，荧光素酶报告基因系统分析SIAH2对PEG10的转录调控作用；免疫共沉淀、免疫荧光共定位和示踪实验分析SIAH2对PEG10蛋白的降解和泛素化修饰作用。建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，证实SIAH2作为肝癌基因治疗分子靶的可行性。该研究为进一步明确SIAH2的生物学功能和PEG10表达的调控机制，寻找肝癌基因诊断和治疗新的靶点提供实验依据。

背景：遗传印迹基因PEG10是参与肝癌发病的特异性癌基因，但调控PEG10表达的分子机制尚不清楚。泛素连接酶可以通过单泛素化方式修饰靶蛋白，调节靶蛋白的功能。当E3发生功能性突变时，其对靶蛋白的调控能力丧失可引起癌蛋白聚集、抑癌蛋白异常降解、细胞凋亡受阻或/和增殖加速，从而导致肿瘤的发生发展。我们的前期研究发现：肝癌组织和肝癌细胞中可检测到SIAH2和PEG10的高表达。我们推测：SIAH2可能是一个癌基因并在维持PEG10稳定性方面发挥了重要作用。 . 内容：体外实验包括①构建靶向SIAH2的 RNA干扰质粒转染肝癌细胞HepG2，观察转染前后细胞内SIAH2、PEG10mRNA和蛋白表达水平的变化及细胞生物学行为的改变。②激光共聚焦和免疫共沉淀技术研究SIAH2与PEG10是否存在相互作用，放线菌酮示踪法观察SIAH2对PEG10蛋白降解的调控作用。体内实验包括①通过RT-PCR、Western blot及免疫组织化学法检测肝癌和相应癌旁组织中SIAH2 mRNA和蛋白表达情况，建立SIAH2的表达与肝癌发生的相关性。②建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，探讨SIAH2作为肝癌基因治疗分子靶的可行性。.结果：体外实验证实①成靶向SIAH2的shRNA干扰载体能显著抑制SIAH2和PEG10 mRNA和蛋白的表达水平，抑制肝癌细胞增殖速度及克隆形成率；使细胞周期明显阻滞于G1期，凋亡率明显升高，体外侵袭和迁移能力受阻。②SIAH2和PEG10在胞浆中存在共定位及相互结合，且SIAH2可以增强PEG10蛋白的稳定性，使其经蛋白酶体途径降解的速度减慢。体内试验证实①PEG10和SIAH2在肝癌组织中表达呈正相关，且阳性表达率明显高于相应癌旁组织中的表达率并与肿瘤TNM分期有相关性。②稳定转染pGenesil-SIAH2的HepG2细胞作为实验组，稳定转染空载体pGenesil-1的HepG2细胞作为阴性对照组，未转染任何质粒的HepG2细胞作为空白对照组。与空白对照组和阴性对照组相比，干扰组肿瘤生长速度明显减慢，且体积及重量明显减小；干扰组裸鼠肝癌移植瘤组织的SIAH2 mRNA和蛋白表达水平明显下降。. 结论：本研究初步阐明了SIAH2促进PEG10蛋白表达的具体机制及其与肝癌发病的相关性，为今后研制高效、特异的新型抗肿瘤药物提供了实验依据。