过表达microRNA319提高多年生黑麦草高温耐受性的机理

The mechanism of plant heat stress responses is a hot research topic in stress physiology. So far the researches on the molecular mechanism of turfgrass heat tolerance are few. Due to their vital roles in post-transcriptional regulation of gene expression, microRNAs have gained great attention in life science and agricultural research. One microRNA gene, microRNA319 (miR319) was found to be involved in plant responses to various abiotic stresses. Here we used a cool-season turfgrass, perennial ryegrass as the plant material, and introduced a rice miR319 gene into the genome of the grass. Transgenic perennial ryegrass showed markedly enhanced heat stress tolerance compared to the wild type. The project will design an experiment with both short and long period high temperature treatments, and will use RNA-Seq technique to screen the genes that show significantly different expression between the transcriptome of the miR319 transgenic perennial ryegrass and non-transgenic plants under heat stress. By combining data association analysis, KEGG metabolic pathway gene enrichment analyses, and gene function confirmation via transgenic analysis with the physiological parameters measured, the project will be able to expound the molecular mechanism of how the heat tolerance is improved in perennial ryegrass by miR319 overexpression. The transgenic plants produced during the project can be useful germplasm materials for breeding heat-tolerant turfgrass/forage. And the project has both theoretical significance and good practical value.

植物对热胁迫的响应机制是胁迫生理研究的热点科学问题。有关草坪草耐热的分子机理尚少见报导。MicroRNAs因其在基因转录后水平调节基因表达的重要作用而成为生命科学以及农业领域的研究热点，其中microRNA319 (miR319)基因被发现参与植物对不同逆境胁迫的反应。以冷季型草坪草-多年生黑麦草为材料，将来源于水稻的miR319基因转入，成功获得转基因植株，经测试转基因植株的耐热性显著提高。计划设置短期和长期的热胁迫试验，采用转录组测序技术筛选转基因植株与非选转基因植株差异表达的基因。通过数据关联分析、代谢通路基因的富集分析，转基因验证，结合从生理水平分析抗逆指标与生物信息数据的关联性，旨在揭示草坪草耐热的分子机理。所获得的转基因材料为进一步通过遗传育种提高草坪草/牧草的耐热性提供了很好的种质材料。试验具有理论探讨的意义也有较高的应用价值。

多年生黑麦草（LoLium perenne L.）作为一种优良冷季型草坪草被广泛应用于普通绿化和球场草坪建植。但是随着全球变暖，高温天气给多年生黑麦草的生长带来了极大的伤害，尤其是过渡带和较暖地区其夏季极端温度甚至会超过40℃，所以对其耐热性的研究十分必要。MicroRNA是真核生物内一类20-24nt的非编码单链小分子RNA，其不仅可以调控植物的生长发育过程，而且参与植物对生物胁迫和非生物胁迫响应。据报道，MicroRNA319（miR319）基因参与植物发育和植物对各种非生物胁迫的反应，包括干旱，盐害和冷胁迫。然而，miR319对植物耐热性的影响尚不清楚。本项目选取过表达 Os-miR319b 基因植株（miR319）和野生型多年生黑麦草植株（WT）为研究材料，通过生理生化指标测定及高温胁迫下转录组和蛋白组分析等方法来研究过表达miR319基因是否能增强多年生黑麦草的耐热性，以及探究miR319对于植物耐热的调节机制。.研究结果表明，miR319基因的过表达导致多年生黑麦草的叶片更宽、更长，植株分蘖数减少。此外，不同高温处理下，与野生型植物相比，转基因植物显示出更强的耐热性。进一步对转基因材料进行了全基因组转录分析发现，与野生型植物相比许多与非生物胁迫相关的转录因子在常温和高温胁迫下出现了差异表达。此外，一些与抗氧化系统相关的基因在热胁迫下在转基因植物中上调。 KEGG代谢通路分析发现茉莉酸（JA）合成与信号传导通路上的一些基因在转基因植株中发生了变化，比如参与活性JA分子（茉莉酸异亮氨酸JA-Ile）合成的基因茉莉酸氨基酸合酶相比野生型植株在常温和高温条件下都有所下调。同时利用TMT技术标记蛋白质组学分析显示WT植株42℃高温胁迫下与对照温度组相比差异表达蛋白质共87个；Os-miR319b转基因植株差异表达蛋白质33个；其中有14个蛋白质同时在两种植物材料中都差异表达。这些差异表达蛋白大多与光合作用、氧化还原反应、应激机制和次级代谢等相关。.本研究为进一步解析水稻Os-miR319b 基因影响多年生黑麦草高温耐受性的机理以及通过遗传育种提高冷季型草坪草/牧草高温耐受性提供了理论基础。