聚乙二醇修饰辅助法复性重组蛋白药物

大肠杆菌是生产重组蛋白药物的主要工具之一，具有繁殖迅速、代谢易于控制的优点。但是，异源蛋白在大肠杆菌体内多形成不溶包涵体，需要经过体外复性恢复其天然结构。如何抑制复性过程中蛋白聚集体的形成是复性成功与否的关键。现有的方法是通过添加剂或界面稳定折叠中间体以减少聚集损失、提高复性收率，一种常用的方法是添加游离的聚乙二醇。我们的工作发现相对于添加游离的聚乙二醇，共价结合的聚乙二醇可以更加有效地抑制聚集体、促进蛋白活性结构的形成。本项目拟以单亚基结构的重组蛋白药物复合干扰素、粒细胞集落刺激因子、单链抗体(抗TNF)为模型蛋白，对其进行聚乙二醇修饰，考察聚乙二醇修饰产物的变、复性行为，并就共价结合聚乙二醇对复性过程的作用机理进行考察；在此基础上，综合分子生物学和聚乙二醇(定点)修饰化学手段，尝试在变性条件下聚乙二醇修饰重组蛋白，然后进行复性，以期发展成为一种新的复性方法。

传统操作中，蛋白体外折叠复性和PEG修饰是两个独立的操作单元，目的分别是将原核宿主细胞(通常是大肠杆菌)表达的包涵体形式蛋白变成有生物活性的可溶蛋白，和进一步将其与PEG链结合以延长其有效期、提高产品品质。单独从过程工程角度，与其使蛋白质产品经历复性和PEG修饰两个环节，不如将两个步骤整合，以减少步骤损失，提高收率、从而降低成本。更重要的是，我们发现，已有的聚乙二醇(PEG)修饰复合干扰素突变体的变、复性研究结果表明：PEG共价结合后，在低浓度下复合干扰素突变体的活性完全恢复，相比之下，没有PEG结合的样品只能恢复30%的活性；即使是在高浓度(2mg/ml)下，PEG修饰复合干扰素突变体的活性回收率仍大于80%，有望突破传统稀释复性方法中复性浓度低带来的操作能力瓶颈。我们分析，这是由于PEG链与蛋白结合后，与其他已知的分子伴侣相比，可以更为有效地在分子尺度上抑制聚集体并促进正确折叠结构的形成。.将PEG修饰与蛋白体外折叠过程整合思路的可行性也已经被其他研究组证明，2013年姚文兵等在World J Microbiol Biotechnol期刊上发表题为PEGylation-aided refolding of globular adiponectin (PEG修饰辅助折叠复性脂联素)的文章，以MAL-PEG修饰脂联素包涵体，然后透析复性，获得活性的PEG修饰脂联素。本项目也先后以复合干扰素、粒细胞集落刺激因子、单链抗体这三种蛋白质药物为对象进行相关研究。然而随着研究的进行，我们发现，为了真正达到该方法的普适性，必须结合结构生物学、分子生物学和过程工程的相关模块，并且真正的应用领域在于非药用蛋白质产品。.为此，我们后期将精力集中在以甲基对硫磷水解酶为对象的研究，目标是开发高活性、低成本、广谱的农药去除剂，用于民用果蔬洗涤剂、果蔬/茶叶/中药原材料等加工过程的农药去除，以及土壤修复等方面。产品雏形已经建立，相关研究已申请国家发明专利3项。