基于Escherichia coli O157:H7亚致死态细胞探究超高压与原儿茶酸协同杀菌机制

It’s an important measure to combine ultra-high pressure processing and bacteriostatic agent to enhance the effect of UHP sterilization. In recent years, studies on such synergistic sterilization technology mostly focused on the sterilization effect, yet there are very rare studies on its mechanism. Our previous studies indicate that not only can the sub-lethal cell revive, it also can respond to secondary stress, such as temperature, pH, bacteriostatic agent etc. Based on this research foundation, we intend to use Escherichia coli O157: H7 to construct a sub-lethal cell model which is suitable for the research on such synergistic sterilization technology. Since sub-lethal cells are able to revive and can respond to secondary stress, we can analyze the changes of cell morphology, cell physiology, cell transcriptome, proteome etc. in depth. In addition, we can make a thorough, multi-level and multi-mode analysis to explain the main mechanism of such synergistic sterilization and bacteriostasis between UHP and protocatechuic acid. The theory above can not only provide a new research mode for exploring the synergistic sterilization technology of UHP, but also lay a solid foundation for the rapid development of UHP sterilization technology.

超高压与抑菌剂协同是强化超高压杀菌效果的重要措施。目前有关这类协同杀菌技术的研究多集中于杀菌效果，而对于其杀菌机制的探索却极为匮乏。我们前期研究表明，亚致死细胞不仅具有可复苏性而且还具有二次胁迫（温度、pH及抑菌剂等）的响应性。基于此研究基础，本项目拟利用Escherichia coli O157:H7构建一种适用于研究超高压协同杀菌技术的亚致死态细胞模型。借助亚致死态细胞模型的可复苏性及二次胁迫的响应性，深入分析细胞形态、细胞生理及细胞转录组、蛋白组等的变化；通过多层次、多模式的剖析，阐明超高压与原儿茶酸协同杀菌、抑菌的主要机制。上述研究可为探索超高压协同杀菌技术提供新的研究模式，同时为超高压杀菌技术产业化的快速发展打下坚实的理论基础。

为了解决超高压（high hydrostatic pressure，HHP）非热杀菌技术易诱导亚致死微生物产生，进而造成食品安全隐患这一问题，本项目通过HHP技术和天然杀菌剂原儿茶酸（protocatechuic acid，PCA）的联合处理达到了完全杀菌的效果。本项目以Escherichia coli O157:H7为处理对象，构建了HHP和PCA诱导的亚致死模型，并以此为基础进行复苏处理和联合杀菌处理，探究不同处理对微生物细胞造成的影响，同时利用转录组-代谢组联合分析对亚致死机制、复苏机制和联合杀菌机制进行探讨。主要研究结果如下：.1.通过选择性培养基平板涂布法分别构建了HHP和PCA诱导E. coli O157:H7亚致死模型，处理条件分别为400 MPa，5 min和1.25 mg/mL,60 min (37 ℃)。.2.HHP亚致死处理会导致细胞膜通透性增加，完整性被破坏，细胞膜去极化，细胞内容物外泄，形态破碎，细胞表面出现孔洞或凹陷，蛋白质二级结构改变；PCA亚致死处理会导致细胞膜通透性增加，但对完整性无显著破坏，细胞内离子外泄，细胞表面皱缩、粗糙，核酸结构改变。.3.HHP诱导的亚致死细胞在适宜条件下会发生复苏，复苏效率和营养丰富程度呈正比，在复苏过程中细胞形态得到恢复，关键酶的酶活增加，细胞内蛋白质含量轻微增加，细胞内ATP含量大量增加。.4.HHP和PCA联合杀菌效果与联合处理顺序相关，HHP+PCA组杀菌效果更好。HHP+PCA和PCA+HHP两组分别在100、200 MPa条件下产生协同效应，当压力达到400、500 MPa时达到完全杀菌。HHP预处理可以帮助PCA进入细胞内部，通过嵌插和沟槽结合的方式和DNA结合。.5.根据转录组学结果，在复苏过程中，氧化磷酸化过程、脂肪酸合成过程和遗传信息传递过程被促进，肽聚糖合成过程无显著响应，表明复苏过程需要能量和蛋白质，细胞膜会先于细胞壁进行修复。.6.根据转录组-代谢组联合分析结果，PCA对E. coli O157:H7的亚致死机制主要是糖酵解、磷酸戊糖途径、嘌呤代谢、脂肪酸代谢和膜脂质代谢受损，细胞会通过促进合成过程，抑制降解过程进行应答。HHP+PCA的联合杀菌机制主要是氧化磷酸化、DNA复制相关过程、肽聚糖生物合成和甘油磷脂代谢受损，进而导致细胞死亡。