穗枯病菌诱导的野生车前草抗性相关基因克隆及功能分析

车前草为江西省特色中药材，其生产状况好坏与江西地方经济发展及药材供应息息相关。近年来，江西吉安市车前草产区严重发生一种新病害车前草穗枯病，给车前草生产造成严重危害。车前草穂枯病防治中面临的一个最大问题是品种单一，缺乏抗病品种。本申请在已筛选到高抗穗枯病野生车前草种质的基础上，用强致病力菌株对之进行挑战接种，采用cDNA-AFLP技术对挑战接种前后的野生车前草构建基因转录图谱，明确抗病野生车前草在与车前草穗枯病菌互作过程中在基因转录水平上发生的变化。对差异表达基因进行克隆、测序和序列分析，明确差异表达基因的功能，鉴定出一定数量的抗病相关基因，为进一步克隆全长抗病基因，开展转基因车前草抗穗枯病研究打下良好基础。

车前草（Plantago asiatica L.）是江西省吉安市重要的经济作物和特色中药材，近年来，车前草穗枯病在当地危害严重。本项目从车前草穗枯病菌分子鉴定、强致病力菌株筛选、野生车前草抗穗枯病种质资源鉴定、穗枯病菌诱导的野生车前草抗性相关基因筛选与功能鉴定等方面开展工作，取得了较为理想的研究成果。.1、采用真核生物通用引物ITS1/ITS4扩增车前草穗枯病菌rDNA ITS序列，对获得的扩增片段进行测序及序列分析，根据序列同源性比较分析结果将车前草穗枯病菌鉴定为当归间座壳菌（Diaporthe angelicae），其无性态属于当归拟茎点菌（Phomopsis angelicae），这是首次从分子水平上明确车前草穗枯病菌的性质。.2、从吉安市不同病区采集车前草穗枯病样品进行病菌分离和纯化，共获得46个菌株，从中选取8个代表性菌株进行致病性测定，结果发现菌株DA-8致病力最强。强致病力菌株的获得为后续野生车前草抗性种质资源筛选和抗病相关基因鉴定奠定了良好的基础。.3、从江西不同地区采集了175分野生车前草种质，采用致病力最强的菌株DA-8对其进行抗病性筛选，结果从中筛选到2份高抗车前草穗枯病种质，而大多数野生车前草种质表现为高感反应。.4、以高抗穗枯病野生车前草种质PPZ14为材料，用车前草穗枯病菌Diaporthe angelicae强致病力真菌菌株DA-8对其接种，采用cDNA-AFLP技术分离接种后不同时间点产生的差异表达基因片段。结果从64对引物组合中筛选到4对多态性丰富的引物组合，并用其进行扩增得到202条差异表达的转录衍生片段（Transcript-derived fragment，TDF），其中以接种24h后出现的TDF数量最多，表明在此时间点车前草与穗枯病菌互作最活跃。对部分TDF进行克隆及序列测定，共获得7个TDF的核苷酸序列和推导的氨基酸序列，经BLAST比对，5个TDF的氨基酸序列在GenBank中找到与其对应的显著同源序列，其中4个为已知功能的基因，对其进行功能分析后，推测认为，决定ACC氧化酶、细胞色素C生成蛋白C、液泡膜H+-ATPase的TDF与车前草抗穗枯病性相关。通过差异表达基因的成功筛选和功能鉴定，在一定程度上阐明了野生车前草抗穗枯病菌的分子机制。