麝香草酚靶向禾谷镰孢菌丙酮酸脱氢酶激酶PDK2的抑菌机制研究

Becaues carbendazim-resistant Fusarium graminearum populations have developed, it is therefore necessary to develop new fungicides to control FHB. Thymol is a kind of phytochemicals, which was found to have antifungal activity against F. graminearum. But the specific molecular drug targets and the mechanism of thymol is unclear. Based on the F. graminearum standard strain PH-1, the following experiments will be carried out: (1) Searching the correlation in thymol induced ergosterlo synthetic inhibition, membrane damage, and death in F. graminearum. (2) Studing the general molecular between thymol and human H_PDK2 or F. graminearum F_PDK2 by bioinformatics methods. (3) Knocking out F_PDK2 genes in PH-1 to confirm its role in the growth and ergosterol biosynthesis in F. graminearum. (4) Mutating of the possible thymol-F_PDK2 interaction sites and analyzing the ergosterol content and the sensitivity to thymol. These studies will contribute to the understanding of molecular mechanism of thymol inhibiting F. graminearum by targeting F_PDK2. And it will provide important scientific proofs of the development of fungicides mainly composed of thymol and fungicide screening based on new targets.

鉴于禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性问题的日益凸显，研发新型高效安全的杀菌剂用于防治小麦赤霉病刻不容缓。麝香草酚具备针对禾谷镰孢菌的巨大抑菌潜力，但其作用的特异性药靶和抑菌分子机制尚不明确。本项目拟以禾谷镰孢菌标准菌株PH-1为材料，完成以下工作:1、研究麝香草酚诱导禾谷镰孢菌麦角甾醇合成抑制、膜损伤、菌体死亡之间的相关性；2、系统分析麝香草酚与人体H_PDK2和禾谷镰孢菌F_PDK2的通用分子互作模式，预测关键的分子互作位点；3、对禾谷镰孢菌F_PDK2基因进行敲除及回复，确认其在禾谷镰孢菌生长发育和麦角甾醇生物合成中的作用；4、对可能的麝香草酚-F_PDK2互作位点进行体外定点突变，分析突变体的麦角甾醇含量及其对麝香草酚的敏感性。从而揭示麝香草酚通过靶向F_PDK2抑制禾谷镰孢菌的分子机制，为今后开发以麝香草酚为主要成分的杀菌剂提供重要的科学依据，同时亦能为基于新药靶的农药筛选提供科学依据。

小麦赤霉病是由禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）引起的一种重要病害，随着多菌灵抗性问题的日益凸显，研发针对禾谷镰孢菌的新型高效杀菌剂，已成为目前有效防治小麦赤霉病的关键突破口之一。植物源化合物麝香草酚，是百里香属植物挥发油的主要成分，具备广谱的抑菌性和高安全性的特点。. 本研究发现麝香草酚显著抑制禾谷镰孢菌菌丝生长和孢子产生。用麝香草酚处理后，病原菌细胞膜透性增大、菌丝甘油、丙二醛（MDA）、和丙酮酸含量显著升高，但麦角甾醇含量显著降低。初步预测麝香草酚可以通过破坏细胞膜，引起形态和生理变化，最后导致细胞死亡。 随后，在人体药物蛋白互作数据库 DRAR-CPI中预测麝香草酚在人体中的靶标蛋白为丙酮酸脱氢酶激酶PDK2；接着在禾谷镰孢菌中同源比对出两个靶标蛋白，分别为PDK1（FGSG_01963）和PDK2（FGSG_07381），并系统分析麝香草酚与人体H_PDK2和禾谷镰孢菌FgPDK的通用分子互作模式。在禾谷镰孢菌标准菌株PH-1中敲除这两个基因，发现对麝香草酚的敏感性显著上升，EC50均下降了50%以上。两个基因敲除体对各种渗透压的敏感性上升，且不积累胞内甘油。缺失FgPDK1的突变体生长速率有所降低，在PDA平板上生长菌落呈白色和黄色；缺失FgPDK2的突变体生长速率显著降低，几乎不产生气生菌丝。两个基因敲除后，均不能产生分生孢子和子囊壳，致病力严重下降,同时DON毒素的产量也明显降低。本项目还测定了麝香草酚处理对禾谷镰孢菌转录组的影响，发现经过麝香草酚处理后的禾谷镰孢菌差异基因大约有1477个，其中下调基因数目为772个，占总差异基因的52.27%,其中丙酮酸代谢过程中大部分基因下调；上调基因数目为705个，占总差异基因的47.73%。这些差异表达基因参与的大多数是细胞代谢路径、生化合成次生代谢物质、减数分裂、丙酮酸代谢、ABC转运、糖酵解等过程。以上结果表明麝香草酚有可能通过影响丙酮酸代谢的过程调控了禾谷镰孢菌的生理生化代谢，影响禾谷镰孢菌的生长。