石斑鱼虹彩病毒SGIV囊膜蛋白VP088在病毒感染过程中的作用机制研究

Singapore grouper iridovirus (SGIV) is a major pathogen resulting in heavily economic losses to grouper aquaculture. However, the molecular mechanisms of iridovirus infection of fish cells are still not fully understood. In the previous work, we had finished the envelope proteomic study of Singapore grouper iridovirus and characterized an envelope protein VP088 to be involved in viral infection and interacted with a host membrane protein. In this study, we plan to further uncover the functions of VP088 in viral infection of fish cells. 1) A recombinant virus with a conditional lethal mutation of VP088 will be constructed. The function of VP088 in viral infection, replication, and assemblage will be tested by using the recombinant virus. 2) The function of VP088 in viral attachment and entry of host cells will be studied. 3) The receptor interacted with VP088 will be identified. The results will fully uncover the function of VP088 and its receptor in viral infection and therefore contribute to the understanding of viral pathogenesis.

虹彩病毒是石斑鱼等主要海水养殖鱼类的重要传染性病原，危害极大。然而，目前对这类病毒侵染鱼类宿主细胞的分子机制仍不清晰。前期我们通过蛋白质组学方法对虹彩病毒SGIV的囊膜蛋白做了全面解析，发现囊膜蛋白VP088参与病毒感染，并能特异性识别宿主细胞膜蛋白。本项目拟在此基础上研究囊膜蛋白VP088在虹彩病毒SGIV感染宿主细胞过程中的功能：1）构建诱导型表达VP088的重组病毒，检测VP088对病毒感染、复制能力及装配的影响；2）利用重组病毒分析VP088在介导病毒黏附和进入细胞过程中的作用；3）鉴定与VP088互作的细胞表面受体蛋白。研究结果将深入揭示囊膜蛋白VP088及其受体在参与虹彩病毒SGIV感染宿主细胞中的作用机制，为阐明鱼类虹彩病毒致病机理，发展抗病毒对策奠定基础。

虹彩病毒是石斑鱼等主要海水养殖鱼类的重要传染性病原，危害极大。目前对这类病毒侵染鱼类宿主细胞的分子机制仍不清晰。前期我们通过蛋白质组学方法对虹彩病毒SGIV的囊膜蛋白做了全面解析，发现囊膜蛋白VP088参与病毒感染，并能特异性识别宿主细胞膜蛋白。本项目拟在此基础上研究囊膜蛋白VP088在虹彩病毒SGIV感染宿主细胞过程中的功能。.成功构建了含有乳糖操纵子系统的SGIV ORF088诱导型表达重组病毒（Recombiannt virus 088，RV-088），通过IPTG诱导调控VP088基因的表达与缺失。通过嘌呤霉素筛选、流式细胞仪分选及连续梯度稀释挑斑法进行重组病毒的纯化。纯化重组病毒后，病毒滴度实验表明，未加IPTG诱导的重组病毒（RV088-IPTG）比加入IPTG诱导的重组病毒（RV088+IPTG）的滴度显著降低。基因转录分析表明，MCP、ORF136 (LITAF)、ORF088、ORF086 (ICP18) 的转录表达水平也显著降低。电镜观察结果表明，RV088-IPTG的病毒结构形态与RV088+IPTG没有显著变化，对病毒的进入特征研究表明，RV088-IPTG在病毒感染2h后进入的数量显著少于RV088 + IPTG，激光共聚焦显微镜观察显示，重组VP088黏附于细胞表面，缺失VP088重组病毒进入细胞内的数量显著少于野生病毒。结果表明，成功建立诱导型重组石斑鱼虹彩病毒，VP088在SGIV病毒黏附与进入细胞过程中发挥关键作用。研究结果揭示了囊膜蛋白VP088在参与虹彩病毒SGIV感染宿主细胞中的作用机制，为阐明鱼类虹彩病毒致病机理，发展抗病毒对策奠定基础。.尝试寻找参与病毒感染的宿主蛋白。在纯化SGIV病毒并进行病毒蛋白质谱鉴定的过程中，发现有7种宿主细胞蛋白，包括细胞骨架微丝肌动蛋白actin能够在提纯病毒过程中和病毒蛋白同时被纯化，并且western印迹实验证实actin在纯化病毒中存在。进一步免疫荧光实验结果表明，在病毒感染晚期，细胞变圆，大部分细胞微丝actin蛋白聚集到细胞表面，和SGIV病毒共定位。结果表明actin在病毒装配与释放过程中发挥着作用。.此外还从石斑鱼肠道分离鉴定了枯草芽孢杆菌等益生菌，具有提高石斑鱼抗病免疫基因表达水平，帮助石斑鱼抵抗虹彩病毒感染的功能。