基于双靶点的藏药蓝花侧金盏杀螨活性成分分离、结构优化及构效关系研究

As one of important veterinary skin diseases, animal acariasis could reduce the productivity and the quality of animal products, and is often fatal. The preliminary studies showed that the extract of Adonis coerulea Maxim. has the acaricidal activity against Psoroptes cuniculi in vitro and in vivo, but the active compounds are still unclear. At the basis of studying the effective parts and the mechanism of A. coerulea, the project will screen and isolate the active compounds from the extract by the target proteins AChE and Na+-K+-ATPase using surface plasmon resonance technology, and the chemical structures were determined by MS, NMR, etc.. Then, molecular docking technology will be adopted to investigate the interaction between the active compounds to the binding site of target proteins, and direct the optimization of structure. After evaluating the acaricidal activities of derivatives of active compounds, the lead compounds with the significant acaricidal activity will be obtained. Finally, the structure-activity relationships and acaricidal molecular model will be established, and this project will provide the theoretical model for designing the new acaricidal molecular and high throughput screening the acaricidal agents from natural products.

动物螨病是引起动物生产性能及畜产品质量下降甚至死亡的一种体外寄生虫病。前期研究发现藏药蓝花侧金盏提取物具有良好的杀兔痒螨作用，通过影响虫体多种酶的活性及表达从而导致螨虫死亡，其中对ACh酶和Na+-K+-ATP酶活性的抑制尤为显著，但药物活性成分尚不清楚。本项目拟以上述两种酶为靶点蛋白，利用表面等离子体共振技术从蓝花侧金盏杀螨有效部位中筛选、分离活性化合物；采用分子对接方法考察活性化合物与靶点蛋白结合位点的相互作用，指导衍生物的合成，并优化其化学结构；应用NMR、MS等多种谱学技术鉴定活性化合物及衍生物的化学结构；通过体外杀螨实验评价衍生物的杀螨活性，以期获得2-3个杀螨活性较好的化合物；建立杀螨化合物定量构效关系及分子模型，为杀螨药物分子设计及高通量筛选提供理论依据。

蓝花侧金盏 (Adonis coerulea Maxim.)为毛茛科侧金盏花属多年生草本植物，具有良好的杀螨活性。在前期工作基础上，按照项目任务书，课题组分别以ACh酶和Na+-K+-ATP酶为研究对象，利用表面等离子共振技术（SPR）从蓝花侧金盏甲醇提取物中捕获高亲和性化合物，经LC-MS等鉴定后，利用分子对接、酶抑制活性等对化合物进行筛选，进而优化其化学结构，发现了系列具有良好杀螨活性的先导化合物。具体的，以AChE为“诱饵”，从蓝花侧金盏提取物中捕获出27个化合物，分子对接研究表明，只有8个化合物的结合自由能低于-10 kcal/mol，其中水飞蓟素（-12.19 kcal/mol）和牡荆素(-11.72 kcal/mol)得分最低，且对AChE的抑制力较强，具有潜在的杀螨活性。以Na+-K+-ATPase为“诱饵”，利用其中ATP1A1亚基从提取物中捕获出12个化合物；其中，乌本苷与靶点蛋白的亲和性较强，其次是没食子酸、铃兰毒苷、毒毛旋花子苷元和罗布麻苷等；分子对接研究显示，乌本苷可与Gln-118、Glu-123、Glu-124、Glu-319和Tyr-804多个氨基酸残疾形成稳固的氢键，以此空间构象来筛选出系列具有潜在杀螨活性的化合物；进一步研究显示，除没食子酸外，其余化合物均对Na+-K+-ATPase有较强的抑制作用，浓度为1mg/mL时对螨虫的致死率为80.12%、58.33%、73.33%和62.21%。鉴于强心苷类良好的杀螨活性，其被认为是蓝花侧金盏的杀螨活性成分；为此，对这类化合物结构进行优化，得到41个衍生物，其中QXG-1对酶的抑制活性和杀螨活性最好，LC50为320.0 μg/mL，且其细胞毒性较小；构效关系研究表明，毒毛旋花子苷元的C-5羟基对杀螨活性至关重要，且C-19位被甘氨酸甲酯所替代可增加化合物的杀螨毒性，并基于机器学习方法建立了定量构效关系，为此类化合物的深入改造和优化奠定基础，也为抗寄生虫药物的研制提供理论依据和支撑；同时，基于ATP1A1亚基，利用计算机辅助药物筛选系统从化合物库中发现高亲和性化合物。以上研究中初步探索出一条藏药抗寄生虫作用机理及活性成分的微量化研究路线，为合理、有效、准确利用自然资源和保护生态提供技术支撑。