植物自噬体形成的分子机制研究

Little is known about the molecular mechanisms of autophagosome formation in plants. Through studying a plant unique BAR domain protein termed SH3P2, we have recently for the first time illustrated the dynamics and ultrastructures of autophagosome formation in Arabidopsis. Further biochemical and genetic studies demonstrated that SH3P2 is a novel regulator of autophagy and autophagosome formation in Arabidopsis thaliana (Zhuang et al., 2013 Plant Cell 25:4596-4615; Zhuang and Jiang 2014, Autophagy 10:4,1-2). Here we propose to study the molecular mechanisms of autophagosome formation in plants. We hypothesize that SH3P2-PI3K complex plays important roles in regulating autophagosome formation in plants. In this study, we will first characterize the multiple membrane origins of plant autophagosome formation. We will also identify and characterize plant-specific SH3P2-PI3K complex components. We will then use transgenic plants to study the function of SH3P2-PI3K complex in regulating autophagosome biogenesis in plants.

在真核细胞中，细胞自噬是将细胞物质吞噬到自噬体降解的保守代谢过程。在酵母和动物细胞中，研究已发现一系列自噬体相关基因（ATG）蛋白参与调控自噬体的形成。而植物自噬体形成的分子机制研究尚处于初步阶段。我们前期研究以拟南芥BAR结构域蛋白SH3P2为标记蛋白，首次揭示了植物细胞中自噬体形成的动态过程。进一步的研究表明SH3P2通过与磷酸肌醇3激酶复合体（PI3K）及自噬蛋白ATG8结合影响植物细胞自噬体的形成及个体生长发育。然而，其具体的细胞分子机制尚不清楚。本项目将进行以下三方面研究：（1）采用免疫荧光、免疫电镜等技术，研究植物自噬体的膜结构来源。（2）通过免疫沉淀、质谱等技术，筛选出植物PI3K-SH3P2蛋白复合体的蛋白组分。（3）综合遗传及各种生化等手段，研究PI3K-SH3P2蛋白复合体各组分在调控植物自噬体形成中的功能。最终，阐明植物自噬作用及自噬体形成的分子机理。

真核细胞具备自噬机制，会将自身的成分降解，回收作其他用途。自噬机制对很多细胞活动非常重要，特别是当细胞面对逆境或遭受病原体感染时，可发挥保护作用。在自噬过程中，一种名为自噬体的细胞器，负责介导细胞内的物质运输到液泡／溶酶体作降解或重新利用。自噬体具有独特的双层膜结构，过去几十年来，研究细胞自噬机制的科学家们，一直致力于探寻自噬体膜的起源。负责调控自噬机制的蛋白称为核心自噬蛋白(ATG)，植物的基因中包含了大部份的ATG，其中ATG9是唯一一个具备跨膜结构的核心自噬蛋白，因此长久以来被认为是自噬体的起源，惟一直未有确实的证据, 因此，本研究的目标之一是阐明自噬体膜的起源。首先，我们结合实时活体内成像、3D断层扫描电子重组技术和遗传学等方法，证明了自噬体膜来源于内质网，并发现植物细胞中的ATG9基因缺失，会导致异常的自噬体小管形成，从而发现了植物ATG9蛋白在自噬体从内质网形成的过程中所起的独特作用。第二， 我们发现自噬蛋白SH3P2与植物特有的FREE1蛋白相互作用，而FREE1蛋白又与磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）相互作用，为了更好的研究由FREE1、SH3P2和PI3K所组成的复合体在自噬体形成中功能，我们对free1突变体开展抑制因数遗传筛选的研究并鉴定到多个与FREE1相关的基因，对这些基因的进一步研究将有助于揭示自噬体的形成机制。此外，我们还深入研究了自噬体与其他细胞器（EXPO分泌体、多囊泡体和液泡）之间的关系。鉴于自噬体在植物抗逆、抗病过程中均具有重要的作用。因此，本项目的研究成果对于农作物抗逆、抗病能力的研究具有一定的理论及实践指导意义。