星型胶质细胞calponin-3调节癫痫发作的机制研究

Recent studies suggest that astrocytes release gliotransmitters (e.g. glutamate, D-serine and ATP), interact with neurons, and contribute to seizures. Calponin-3 is a calcium and calmodulin binding protein, and may inhibit the activity of ATPase. Our previous studies show that the level of neuronal and astrocyte calponin-3 in epileptic patients and animals were significantly up-regulated. Additionally, the susceptibility to epilepsy in experimental rats was changed after silencing or over-expression of CNN3 gene. However, we failed to find any article related to abnormal calponin-3 in the astrocytes. Thus we hypothese that abnormal calponin-3 may influence the activity of cellar ATPase and CaMKⅡin the brain, interrupt homeostasis astrocyte-neuron network, and contribute to epilepsy. We plan to study seizure modulation by calponin-3 in astrocytes on the brain tissue of epileptic patient and animal model, using immunohistochemistry and western blot and conditional knockout of CNN3 gene and observation etc. The study may help to reveal how to modulate astrocyte-neuron network, and lay a foundation for development of new antiepileptic drugs.

最近发现星型胶质细胞能释放谷氨酸、ATP、丝氨酸等胶质递质，与神经元相互调控，参与癫痫发病。申请人前期工作发现可调控ATPase活性的钙/钙调蛋白结合蛋白calponin-3不仅在癫痫患者及动物神经元和星型胶质细胞过表达，沉默/过表达其CNN3基因还会改变鼠的癫痫易感性。但尚未见研究星形胶质细胞calponin-3表达改变意义和机制的报道。故我们提出假说：异常的calponin-3可改变脑细胞中ATPase及CaMKⅡ的活性，破坏星形胶质细胞-神经元网络稳态，进而促成癫痫发作。为此，我们将通过患者脑组织、实验鼠，利用免疫染色、western blot、定磷法、放射酶法、条件性基因敲除和行为学观察等手段，明确星形胶质细胞calponin-3蛋白过表达参与癫痫发作的调控机制。本研究将从calponin-3这个新视点揭示星形胶质细胞-神经元网络调控机制和为开发新型抗癫痫药奠定基础。

癫痫是一种由脑部神经元异常同步放电引起、以反复癫痫发作为特征的临床综合征，目前全世界约百分之一的人罹患癫痫。癫痫的发病机制十分复杂，基于目前的抗癫痫靶点,约1/3的癫痫患者对目前的抗癫痫药物耐药,迫切需要寻找新的抗癫痫靶点。申请人前期对耐药性癫痫患者颞叶组织进行基因芯片扫描，发现癫痫患者CNN3基因表达显著上调，其编码的钙/钙调蛋白结合蛋白calponin-3在星胶及神经元均有表达；在动物实验中，沉默/过表达实验鼠CNN3基因后其癫痫易感性发生改变，且可调控ATPase活性。为验证该项目提出的假说“异常的calponin-3可改变脑细胞中ATPase及CaMKⅡ的活性，破坏星形胶质细胞-神经元网络稳态，进而促成癫痫发作”，团队成员积极开展多项创新性研究，利用患者脑组织及实验鼠，构建了癫痫动物模型及定位敲低海马神经元或星形胶质细胞内CNN3与特异性敲除全脑神经元CNN3基因鼠，采用免疫染色、western blot、定磷法、ELISA和行为学观察等技术，从动物整体、组织和细胞层面上，对神经元突触后膜的calponin-3与耐药性癫痫形成开展功能研究。项目实验已探明Calponin-3、ATP总酶、Na-K-ATP酶、CAMKⅡ在癫痫脑内的变化关系，改变海马总的calponin-3水平后，实验鼠的癫痫易感性改变，海马内calponin-3水平的变化，可能参与CaMKII调解癫痫易感性有关；建立特异性敲低海马神经元、星形胶质中CNN3小鼠模型；在造模成功的癫痫鼠中，确定了抗癫痫药物LEV、VPA对癫痫鼠CNN3无影响，但会改变CAMKⅡ表达水平；团队已完成了CNN3 flox+/+ 小鼠与Syn1-cre小鼠扩繁，得到F1代CNN3 floxp+/- syn1 cre/+小鼠，并将F1代小鼠交配，得到全脑神经元CNN3特异性基因敲除鼠F2代（CNN3 floxp+/+ syn1 cre/+）,IF验证敲低成功，并用F2代进行点燃观察行为学。项目研究进一步明确了calponin-3参与癫痫易感性调控，为了解癫痫发作中星型胶质细胞-神经网络稳态调节提供全新视角，为实现新药开发开辟新靶点。