宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌毒力基因的检测及多重耐药机理研究

The aim of the study is to investigate the relationships between the virulence genes of bovine Staphylococcus aureus and resistance in Ningxia by molecular biology techniques, and investigate the multi-drug resistance mechanisms of Staphylococcus aureus mediated β-lactamase enzyme. The virulence genes are tested by PCR and MIC is performed using micro-dilution method, then the correlation is analyzed between them. The strains producted β-lactamase enzyme are screened by Nitrocefin paper. Then BLA genes are amplificated by PCR, these gene sequences are detected to determine the genotype of BLA,thus the relationship between genotype and phenotype is explored. The strains of MRSA are tested by Cefoxitin paper, the mec gene is amplificated by PCR. Then the mec complex typing, the ccr complex typing and MRSA typing by PFGE will be done, thus the resistance mechanisms of MRSA are revealed. Through comprehensive analysis, the multi-drug resistance mechanisms of Staphylococcus aureus mediated BLA will be determined. The significance is important to prevent the drug resistance of Staphylococcus aureus and the effective treatment infectious diseasea of Staphylococcus aureus.

应用分子生物学实验技术，研究宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌毒力基因和耐药性之间的关系，以及β-内酰胺酶（BLA）介导的金黄色葡萄球菌的多重耐药机理。通过PCR方法调查毒力基因，用微量稀释法测定药物的MIC，从而分析它们之间的相关性；通过Nitrocefin纸片显色法筛选产β-内酰胺酶菌株，PCR扩增产酶菌株BLA基因，测定其基因序列，确定BLA的基因型，从而探究其基因型与耐药表型的关系；通过头孢西丁纸片法检测MRSA菌株，PCR扩增mec基因，并进一步进行mec复合体、ccr复合体的分型，采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对MRSA菌株进行分型，从而揭示MRSA的耐药机制；通过全面分析，明确BLA介导的金黄色葡萄球菌的多重耐药机制，对预防金黄色葡萄球菌耐药性产生及有效防治金黄色葡萄球菌感染性疾病具有重要意义。

随着兽医临床抗菌药物的过度使用，导致细菌的耐药性及其多重耐药性已严重影响了兽医临床疾病的治疗，因此对宁夏地区牛源金黄色葡萄球菌进行毒力基因检测和耐药机制的研究，不但对金黄色葡萄球菌引起的疾病防治具有指导意义，而且有利于控制耐药菌株的产生和传播。本项目主要进行了以下4个方面的研究：.1、采集宁夏地区奶牛乳房炎乳样，进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定；通过PCR方法调查了主要的7种毒力基因；采用肉汤微量稀释法测定了261株金葡菌的MIC值，分析它们之间的相关性。结果显示，金葡菌对氨苄西林的耐药率最高，达到79.74%，其次是青霉素、复方新诺明，而对头孢类及喹诺酮类药物的敏感率则在60%以上；7种毒力基因hla、hlb、clfa、pvl、sea、seb、sec的检出率分别为99.1%、97.4%、98.3%、1.73%、27.7%、29.0%、5.6%，且同时携带hla、hlb、clfa三种毒力基因的检出率最高，达到了45.9%。经分析，耐药表型与毒力基因之间不存在相关关系。.2、通过青霉素边缘实验进行产β-内酰胺酶的表型确证，然后PCR扩增产酶菌的β-内酰胺酶基因blaZ、blaTEM、blaCTX-M、blaOXA和blaSHV等。结果261株金黄色葡萄球菌中检出147株产β-内酰胺酶菌株，产酶率为56.32%，其中143株携带blaZ基因，其他基因均未检出。经分析，携带blaZ基因的143株菌中，95%左右的菌株对青霉素和氨苄西林耐药，对其他抗菌药物的耐药率也普遍高于β-内酰胺酶阴性菌。.3、对MRSA菌株进行鉴定并进行PFGE、MLST 分型、spa分型、SCCmec分型。结果仅鉴定出9株MRSA ，说明MRSA目前还没有在宁夏奶牛群中流行；经耐药率分析发现，MRSA比MSSA分离株具有更高的耐药水平。对9株MRSA进行PFGE分型发现分离自同一个奶牛场的5株MRSA均为同一基因型，说明在宁夏地区牛源MRSA主要通过克隆传播。9株MRSA中，MLST 分型主要为ST239型，spa分型主要为t037型，SCCmec分型主要为III型。.4、对9株MRSA和随机选取的116株MSSA菌株进行了各种分型研究。结果125株临床分离株有16种spa型，主要类型为t224；产生了11个不同的ST型，主要类型为ST50，新发现的ST4053和ST4066，分别属于CC97和CC5。