microRNA-181c在慢性心力衰竭中的作用及其机制分析

充血性心力衰竭（心衰）发病机制复杂，缺乏有效的防治措施。最近研究表明microRNA在心脏发育、心肌凋亡、血管生成等环节都起着重要的调控作用。我们应用microRNA芯片和定量PCR发现miR-181c在衰竭的心肌组织显著上调。生物信息学分析显示，心肌脂肪酸代谢信号通路中PPARα、FAT/CD36、SCD等重要分子均为miR-181c的潜在靶基因。心衰时心肌细胞脂肪酸代谢存在障碍，脂肪酸及其氧化利用程度明显下降。我们将探讨miR-181c在心衰能量代谢障碍中的调控作用及其机制：分离及培养心肌细胞，通过慢病毒载体介导miR-181c过表达及敲减，探讨其对心肌脂肪酸代谢的作用及信号通路；荧光素酶报告实验验证miR-181c的下游靶基因；构建心衰小鼠模型，通过尾静脉注射miR-181c反义寡核苷酸观察对心功能、心室重构的影响。认识miR-181c在心衰中的关键作用将为抗心衰药物开发提供新靶点。

我们课题组前期基础表明衰竭心肌中microRNA-181c显著上调。本研究主要探讨了miR-181c在心力衰竭中的作用及机制。我们应用细胞培养、脂质体转染、荧光素酶分析、RT-PCR、Western blot技术、及透射电镜等手段在乳鼠心肌细胞中进行了实验，首次发现：（1）抗凋亡蛋白Bcl-2是心肌细胞miR-181c的靶基因。（2）上调miR-181c后，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，而凋亡蛋白Caspase-3、Cyto-C表达明显升高。转染miR-181c inhibitor下调miR-181c表达后，Bcl-2蛋白表达升高，Caspase-3、Cyto-C蛋白表达下降。（3）转染miR-181c mimic/inhibitor 入乳鼠心肌细胞，应用TNF-α（10ng/ml，1h）处理心肌细胞，分离线粒体，透射电镜技术观察心肌细胞大体形态、线粒体数量及形态变化。结果显示下调miR-181c可减轻TNF—α诱导线粒体凋亡。（4）从分离的线粒体内未发现到PCR可以检测出的miR-181c及pre-miR-181c，表明miR-181c的生物合成是通过常规途径，并且存在于细胞浆内发挥作用。根据课题组前期基础（衰竭心肌中miR-19b显著下调）及本课题掌握的技术及实验方法，利用本课题实验条件，同时探讨了miR-19b对心力衰竭的调节作用及机制，研究发现：促心肌纤维化因子——结缔组织生长因子（CTGF）为miR-19b靶基因；AngII可下调miR-19b表达，促进CTGF表达，AngII拮抗剂替米沙坦可部分拮抗上述作用；miR-19b介导AngII诱导CTGF表达及心肌纤维化。. 本研究首次证实Bcl-2为心肌细胞miR-181c靶基因，揭示miR-181c通过调节抗凋亡基因Bcl-2表达参与心力衰竭心肌细胞凋亡，miR-19b通过调节促心肌纤维化因子CTGF表达介导血管紧张素II诱导的心肌纤维化过程。揭示了miR-181c及miR-19b在心衰中的角色和机制，为进一步探讨心力衰竭过程中细胞凋亡及纤维化调控分子机制提供了重要线索，为揭示小分子miR与心衰的关系提供了关键实验依据。