草鱼肠道抗菌肽A基因转录调控的分子机理

抗菌肽是鱼类肠道粘膜免疫系统中一类可诱导的具有广谱抗菌活性的免疫分子，在鱼类控制肠道微生态环境和抵御病原微生物的入侵的过程中发挥重要作用。基于我们在草鱼肠道粘膜细胞中分离纯化的抗菌肽A（AP-A），以及对其抗菌活性和理化性质研究的基础上，本项目提出进一步研究AP-A表达调控的分子机理，拟构建草鱼的基因组文库，克隆AP-A基因，并构建含有不同顺式元件缺失的调控序列和报告基因的融合表达载体，转染草鱼肠粘膜上皮细胞(IEC)，在病原菌诱导后检测报告基因的表达水平，分析AP-A基因转录调控的顺式作用元件的功能；进而利用RNAi抑制IEC细胞TLRs的表达来确定AP-A基因转录调控的信号途径和利用一些核因子的特异性抑制剂来分析转录调控过程中核因子的功能，揭示AP-A基因转录调控的分子机理，研究成果对于认识鱼类肠道粘膜的免疫机制具有重要意义，为鱼类病害的防治以及抗菌肽的开发利用提供了理论和实践依据。

本项目自2012年实施以来，主要完成以下研究内容：1. 按照申请书研究方案，采用GenomeWalker的方法来扩增草鱼肠道抗菌肽A基因的上游序列，获得长度750 bp的序列，测序结果与已知序列不符，其原因可能是由于AP-A基因中存在内含子，设计的引物可能被内含子分开，从而导致引物不能与DNA模板结合，出现非特异性扩增；2. 由于本项目的研究期限由申请书中的3年变为实际执行的1年，原研究计划不可能完成，因此根据申请书研究方案，结合目前的实验技术，对研究内容3作了一定修改。采用嗜水产气单胞菌人工诱导成年草鱼，以健康草鱼为对照，提取肠粘膜上皮细胞总RNA，RNA样品送交华大基因公司进行转录组分析，测序量为4.7G，经序列组装后获得57,417条cDNA序列，序列分析结果表明：a. 获得本项目研究内容中所需的除TLR4以外的全部TLR（TLR1，2，5，6）序列和各TLR信号途径中的绝大部分基因序列；c. 获得两个抗菌肽基因序列，其中一个表达升高较为明显，另一个表达水平无明显变化，而本项目研究对象AP-A基因序列未能获得；b. 从利用病原体诱导后的草鱼中获得了表达明显升高的免疫相关基因，TLR信号途径中有多个基因的转录明显上调，如TLR信号途径(TLR3途径除外)所必需的MyD88的表达水平升高接近3倍，与TLR4途径有关的MD2和TRAM均上调2倍以上，一些炎症细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-12和IL-8，共刺激分子(costimulatory molecules)如CD40、CD80和CD86的表达也明显上调，调控BD2表达的MEK1/2和p38的表达升高约2.5倍，这一结果表明采用口服嗜水产气单胞菌来诱导健康草鱼，能通过TLR信号途径激活机体包括特异性和非特异性在内的免疫反应。项目执行期间培养硕士研究生3名，并完成3名本科生的毕业论文；有2篇研究论文正在撰写，预计将在2013年内公开发表。