不同生物型和基因型牛病毒性腹泻病毒诱发致死性黏膜病的分子机制研究

Bovine Viral Diarrhea and mucosal disease is a viral infectious disease caused by BVDV, which fatal mucosal disease is one of the most dangerous clinical symptoms with 100% high mortality rate. The pathogenesis of fatal mucosal disease remains unknown until now. In order to explore the mechanism of fatal mucosal disease and clarify the relationship of fatal mucosal disease between two BVDV biotypes and three genotypes, our studies will employ three genotypes (genotype 1, 2, and 3) of CP BVDV as materials to construct full length of cDNA infectious clone through a reverse genetic technology, and construct a subgenomic infectious clone through relevant genes deletion and will rescue the mutant virus to obtain three genotypes of NCP BVDV (genotype 1, 2, and 3). Then, test animals will be infected with the three genotypes of NCP BVDV to set up persistent infection(PI) model, and PI animals will be infected with the same antigenicity and different antigenicity of CP BVDV once again, respectively, to set up the different fatal mucosal disease models. After that，we will explore the molecular mechanism of fatal mucosal disease induced by BVDV with the analysis of pathological changes，the tissue distribution of BVDV，antibody levels changes, the regulation of immunocytes etc. It will establish the theoretical foundation for pathogenesis of bovine viral diarrhea disease and immune prevention.

牛病毒性腹泻-黏膜病是由BVDV引起的一种病毒性传染病，致死性黏膜病是BVD最严重的一种临床类型，死亡率可高达100%，其发病机理至今不清。为了探索致死性黏膜病的发生机制及其与BVDV两种生物型和三种基因型之间的关系，本研究拟用三种基因型的CP型 BVDV（基因1型、2型和3型）为材料，通过反向遗传技术构建全长cDNA感染性克隆，通过缺失相关基因构建亚基因组感染性克隆并拯救病毒，获得三种基因型的NCP型BVDV（基因1型、2型和3型）配对病毒；以构建的三种基因型的NCP型 BVDV感染试验动物，建立持续性感染模型；以抗原性相同和不同的CP型 BVDV再次感染持续性感染的试验动物，建立不同类型致死性黏膜病感染模型；通过分析病理变化、BVDV的组织分布情况、抗体水平变化、免疫细胞变化规律及细胞因子变化等，探索BVDV导致致死性黏膜病的分子机制，为牛病毒性腹泻病的致病机理和免疫预防奠定理论基础。

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea, BVD）的病原，目前尚缺乏有效防治手段，使BVD成为全球性传染病，对我国乃至全球养殖业国家造成了巨大的经济损失。已有研究表明持续性感染动物是BVDV引入畜群的主要来源，且持续性感染动物再次感染相同基因型Cp型BVDV则可能诱发黏膜病。BVDV作为单股正链RNA病毒，反向遗传技术已经成为了研究BVDV的重要工具。.本研究拟采用RNA聚合酶Ⅱ系统对BVDV进行反向遗传操作，构建BVDV反向遗传RNA聚合酶Ⅱ系统，拯救病毒rY2。采用BALB/c小鼠和新西兰大白兔，在孕期前1/3使用Ncp型BVDV感染怀孕母畜，构建子代持续性感染模型，以基因型相同和不同的Cp型BVDV再次感染子代，诱导不同类型黏膜病模型。通过分析病理变化、BVDV的组织分布情况、抗体水平变化、免疫细胞变化规律及细胞因子变化等，探索BVDV导致致死性黏膜病的分子机制。.成功构建pBR322-rY2感染性克隆，并拯救出rY2，测定重组病毒rY2 TCID50为10-5.25/0.1mL，重组病毒rY2与亲本病毒Y2具有相似的生长特性。小鼠和兔实验构建了抗原阳性、抗体阴性的子代持续性感染模型。给予持续性感染模型仔畜基因型相同和不同的Cp型BVDV建立黏膜病模型。通过分析病理变化、抗体水平变化、免疫细胞变化规律及细胞因子变化等，表明成功构建了小鼠与兔持续性感染模型，并阐明持续性感染模型再次感染相同和不同基因型Cp BVDV均会诱发黏膜病，且在兔黏膜病模型构建中，延长观察时限，发现仔兔二次感染Cp型病毒2周后表现出明显临床症状。与对照组比较，黏膜病模型动物白细胞和血小板水平均显著降低，淋巴细胞呈现减弱趋势，机体处于免疫抑制状态。血清TNF-α与IFN-γ水平均降低，而促炎因子IL-1β水平则明显升高。病理结果显示模型组动物全身多器官病变，消化系统多见黏膜层细胞脱落，局部可见淋巴细胞浸润。.综上，本研究构建BVDV反向遗传RNA聚合酶Ⅱ系统并获得拯救病毒rY2；构建BALB/c小鼠与新西兰白兔持续性感染模型，并阐明持续性感染模型再次感染相同和不同基因型Cp型BVDV均可能会引发黏膜病；初步揭示了BVDV诱导的黏膜病可能是通过引起机体免疫抑制从而实现免疫逃逸的。