中国特有种——沙芥SSR引物开发及其遗传图谱构建

沙芥是十字花科沙芥属二年生草本植物，为中国特种，是一种携带抗旱、抗寒、耐盐和耐沙埋等多种优良基因，并集防风固沙、菜用、生物能源植物于一体的多功能沙生蔬菜。由于沙芥分子生物学研究尚处于起步阶段且其野生群体高度杂合，其遗传图谱至今尚无人构建，这在很大程度上影响了对沙芥优良基因的定位、克隆、基因结构与功能的分析及分子标记辅助育种的应用。本课题组多年从事沙芥引种驯化和育种工作，现已具备用于沙芥遗传图谱构建的群体材料，拟采用FIASCO磁珠富集法开发适于沙芥分子遗传图谱构建的SSR引物，并利用开发的引物进行沙芥遗传图谱的构建，为其基因定位、克隆、比较基因组结构和功能分析及分子标记辅助育种等研究奠定基础，丰富沙芥分子生物学的研究内容。

用高通量Illumina测序技术进行沙芥SSR引物的开发及叶片表达图谱的分析, 应用SSR和SRAP分子标记进行了沙芥遗传图谱的构建。沙芥叶片转录组中找到符合条件的EST-SSR 6,273个，Unigene发生频率9.86%。其中5,548个Unigene上找到单个SSR，占全部SSR的88.44%。沙芥的SSR频率为10.27%，均长19.66。SSR的repeats重复出现的次数主要分布于重复次数在4-7之间，repeats的类型主要是三核苷酸型，并筛选出152条SSR引物用于遗传图谱的构建。同时利用510对油菜（Brassica. napus）的EST-SSR引物进行PCR转移扩增来筛选沙芥SSR引物，获得可用于沙芥的SSR引物10对，其扩增转移成功率仅为1.96%。采用FIASCO法筛选沙芥微卫星标记26对。沙芥叶片转录组共获得了72,423,700条Reads；拼接得到61,093条Unigene；通过COG功能可将获得的Unigene分为25类；GO分析可分为55个分支，其中生物过程有24个，细胞组分有15个，分子功能有16个；共得到128条Pathway，沙芥叶片转录组中主要的Pathway有代谢途径、次生代谢合成和信号传导方面。利用单因素设计和正交组合设计，进行了沙芥SSR和SRAP反应体系优化：SSR反应体系：Mg2+、dNTPs和引物的最适浓度分别为1.5mmol/L、0.2 mmol/L、0.2μmol/L，Taq酶0.2U，模板DNA 20～30 ng；SRAP反应体系：Mg2+、dNTPs和引物的最适浓度分别为1.5mmol/L、0.2 mmol/L、0.2μmol/L，Taq酶0.3U，模板DNA 70ng。并利用SSR和SRAP分子标记进了沙芥分子遗传图谱构建，沙芥遗传图谱包含7个连锁群、175个分子标记，其中SSR标记152个，SRAP标记23个，图谱全长416cM，平均图距2.47cM。