两种中药抗耐药金葡菌活性成分和作用机制研究

中草药中多种类型化学成分与现有抗生素分子结构可能完全不同，本身不能为耐药菌所识别作为外排泵的基质因而抑制了耐药性；或者与原先作为基质的药物分子通过亲和作用(affinity)形成复合物(complex)后不再被耐药细菌识别排出细胞外，药物能够重新发挥作用。前期研究中我们发现中药紫草和阿魏提取物具有耐药菌抑制活性，并且从中分离到抗耐药金葡菌萘醌，苯多烯，以及新的紫草萘醌二聚体，倍半萜香豆素等多种结构类型的化合物。在此基础上，对凉血解毒中药新疆紫草和中药阿魏进行抗MDR MRSA活性成分及其抗耐药性作用机制的研究。以具有msrA, tekA和qacA等外泵型耐药基因的六种MRSA耐药金葡菌为靶标，跟踪分离及制备抑制耐药金葡菌系列化合物。通过药物组合物和外排泵抑制实验，对分离得到的化合物进行细菌外泵抑制实验，并探讨其耐药菌抑制或外排泵抑制活性构效关系，最终得到中药抗耐药或抑制外泵作用活性物质。

一、项目背景.耐甲氧西林金黄葡萄球菌 (MRSA) 是医院内的一种常见严重的传染病菌。耐药细菌通过外排泵 (efflux pump) 蛋白减少药物摄入细胞而产生耐药性。中药紫草(Arnebia echroma)和阿魏(Ferula spp.)含有多种类型化学成分与现有抗生素分子结构完全不同的化学成分。这些天然成分不能为耐药金葡菌识别为外排泵的基质因而可能抑制耐药性，使抗生素重新发挥作用。.二、研究内容.1. 中药阿魏和紫草化学成分的分离和结构鉴定；阿魏化学成分的化学结构修饰。高斯方法计算天然化合物的电子圆二色谱(ECD), 对比实验实验数据分析化合物的立体化学绝对构型。.2. 阿魏和紫草化学成分抗耐药金葡菌抗菌活性测试；中药化学成分抑制耐药金葡菌NorA外排泵(efflux)活性测试。紫草和阿魏中萘醌和香豆素倍半萜化合物对诺氟沙星的协同作用抗耐药金葡菌实验。尝试了生物自显影法抗菌活性天然成分筛选。.3. 建立和完善协同抗菌筛选平台(SASP)。.4. 运用SASP扩大中药筛选范围，对豆科槐属协同抗菌植物，进行了探索性的植物成分分离，抗菌协同活性测试。.5. 对潜在协同抗菌作用的中药十大功劳属(Mahonia)植物进行了文献调查研究。.6. 计算机辅助药物设计方法进行萘醌类化合物抑制耐药菌外排泵的对接拟合计算。.7. 探索性试验活性化合物对耐药金葡菌外排泵基因的下调作用。.三、重要结果.1. 得到与抗生素产生协同抗菌作用的倍半萜香豆素、萘醌类物质。分离得到与现有抗生素结构类型不同的抗耐药金葡菌倍半萜和萘醌类天然化合物，活性明显强于对照药物抗生素，细胞毒性低；在活性化合物分离方面达到了预期目标。.2. 建立了包括微孔棋盘方法和时间杀菌曲线方法的天然产物协同作用筛选平台；完善了耐药细菌外排泵化合物评价方法。.四、关键数据及其科学意义.1. 从中药阿魏分离到2个倍半萜苯乙酮具有金葡菌NorA外排泵抑制作用，5个香豆素具有协同抗菌作用，能将抗生素最低抑菌浓度(MIC)降低至单独用药的1/8。紫草中30个天然萘醌类化合物中22个为新化合物。其中协同活性萘醌将诺氟沙星和链霉素MIC降至它们单独用药浓度的128 - 16倍。这一结果有利于抗生素老药新用或降低抗生素使用剂量。.2. 得到没有直接抑菌作用但协同抗菌的天然化合物，可能进一步发现抑制细菌耐药而不产生新的耐药性的化合物。