着丝粒粘连蛋白E 的单分子生物物理学研究

在细胞有丝分裂过程中，着丝粒粘连蛋白E（CENP-E）在染色体运动和排列、纺锤体检验点失活以及中心纺锤体可塑性等方面具有重要的功能地位。目前有关CENP-E的研究多集中在对其在细胞内的功能表现、相互作用蛋白以及调控途径等方面，而能够反映CENP-E本身性质的单分子研究还很少。我们拟采用全内反射荧光显微镜和光镊技术，在单分子层次上评估马达蛋白CENP-E沿微管蛋白行走过程和测量它们相互作用的单分子力谱，研究(1)CENP-E与微管表面作用的基本动力学特性及构-效关联；(2) 蛋白激酶BubR1的磷酸化作用对CENP-E单分子特性的调节作用；(3)CENP-E的小分子抑制剂syntelin对CENP-E单分子运动行为的影响;(4)在微管聚合/解聚过程中CENP-E与微管相互作用的动力学特性。利用物理学方法评估CENP-E的单分子行为，为全面阐明马达驱动蛋白在有丝分裂中的系统生物学奠定基础。

在细胞有丝分裂过程中，着丝粒粘连蛋白E（CENP-E，属于Kinesin-7）在染色体运动和排列、纺锤体检验点失活以及中心纺锤体可塑性等方面具有重要的功能地位。目前能够反映CENP-E 本身性质的单分子研究很少，并且缺乏统一的共识。在该项目一年的资助和中国科大姚雪彪教授提供生化条件的支持下，我们攻克单分子操纵的实验方法和高精度光镊系统搭建等难关，实现了对CENP-E的单分子操纵。.首先以活性好的Kinesin-1为对象摸索掌握单分子检测方法，在我们光镊系统上检测到了Kinesin-1的运动速度（461nm/s）和马达域与微管蛋白之间的解离力，其结果均与国际文献结果一致。在相同ATP浓度下检测， CENP-E沿微管蛋白运动速度（30.6nm/s）比Kinesin-1要慢很多，这一现象结果与加州大学Cleveland课题组（JCB，2008）采用全内反射观察运动速度的结果相近，而与哥伦比亚大学Rosenfeld课题组（PNAS,2008）采用光镊开展的单分子检测结果差别较大。此外，在光阱中CENP-E的解离力小于Kinesin-1。关于CENP-E单分子特性有待深入验证，后续工作还将开展单分子测量CENP-E的动力参数和结合蛋白影响下CENP-E的单分子特性。.理论模拟（势能模型和蒙特卡洛方法）Kinesin的运动规律以指导单分子实验。kinesin沿微管运动的速度随着ATP浓度增大而增大，当ATP浓度达到毫摩尔时，速度趋于稳定值。在施加光阱力作为负载时，Kinesin运动速度将变慢，这与我们实验观察结果一致。在ATP浓度较低时，kinesin马达域与微管蛋白相互作用承受的张力越大，kinesin反而停留在微管蛋白的时间越长。.在本项目中搭建高精度光镊系统是深入开展单分子实验的前提，我们设计搭建一套适合单分子生物物理研究的高精度光镊系统（设备经费另筹），具有光阱力>100pN，达到2nm的空间分辨率等特性；提出了“一种俘获及探测复用的扫描光镊系统”系统设计（申请发明专利）；采用矢量光线追迹模型研究不规则颗粒的光阱力发表在Optics Express（物理类二区）。.在本项目资助下，我们已经建立了单分子研究生物大分子相互作用的技术方法和物理模型，检测到了CENP-E单分子的直接信息，其进展是后续研究CENP-E的动力参数和结合蛋白影响下CENP-E的单分子特性的重要前提。