PIG7在AML1-ETO白血病分化凋亡中的作用

AML1-ETO是一种常见于急性髓系白血病的癌蛋白，我们前期发现HDAC抑制剂在诱导AML1-ETO型白血病细胞分化凋亡时，PIG7的表达上调，并且PIG7可以增强白血病细胞对化疗药物的敏感性。本项目拟从5个方面深入研究PIG7在AML1-ETO白血病分化凋亡中作用：①PIG7在AML1-ETO原代白血病细胞诱导分化凋亡前后表达的变化；②阐明AML1、AML1-ETO对PIG7的转录调控作用；③PIG7对AML1-ETO白血病细胞系分化凋亡的作用；④PIG7对AML1-ETO白血病细胞系小鼠体内致瘤性的作用；⑤PIG7对原代AML1-ETO白血病细胞分化凋亡的作用。通过本项目的研究将阐明PIG7在AML1-ETO白血病分化凋亡中的作用，明确PIG7作为AML1-ETO白血病治疗靶点的可能性，为AML1-ETO白血病的靶向治疗提高理论基础。

研究目的：观察AML1b基因及其融合基因AML1-ETO对pig7基因启动子转录活性的影响，探讨AML1与pig7的相互作用在白血病发生中的机制，并通过功能性实验阐释pig7对白血病细胞增殖活性的影响。.研究方法：AML1b和AML1-ETO表达质粒分别转染及共转染CV-1和293细胞，用Realtime-PCR方法检测上述基因对两种细胞内源性pig7基因mRNA表达水平的影响；构建含AML1b结合位点的pig7基因增强子序列以及相对应的突变位点的荧光素酶报告基因质粒；将表达载体/突变载体与AML1b或(和)AML1-ETO基因瞬时共转染CV-1细胞，分析AML1b、AML1-ETO对报告基因的转录调节作用。构建含有pig7开放读码框（ORF）的慢病毒表达载体pCDH-pig7及含有pig7反义片段的慢病毒表达载体pCDH-anti-pig7，并分别导入白血病细胞，表达pig7基因及干扰RNA片段，研究该基因的生物学功能。.结果：转染AML1b的两种细胞系，其内源性pig7基因mRNA表达水平均明显上调；含有转录起始位点上游1511至1503的TTTGTGGAT序列的荧光素酶报告基因质粒的表达活性与共转染的AML1b质粒剂量呈明显的“剂量-效应”关系，荧光素酶表达活性上调最高达3倍（P<0.05）；而AML1-ETO在不同剂量条件下对荧光素酶表达活性调节均无统计学差异（P>0.05）。在一定剂量范围内，共转染的AML1-ETO可拮抗AML1b的调节作用。应用pCDH慢病毒系统成功构建并包装出pCDH-pig7慢病毒及pCDH-anti-pig7慢病毒,体外感染白血病细胞系Kasumi-1和NB4后，在细胞高表达pig7蛋白的同时，Kasumi-1细胞出现明显的凋亡和分化趋势，而NB4细胞增殖率并无明显变化，但联合应用药物全反式维甲酸（ATRA）作用于NB4细胞后，也表达出明显的促凋亡和分化作用（P<0.05）；当细胞内源性pig7表达受到抑制的同时，Kasumi-1及NB4细胞均对药物表现出不同程度的耐受性（P<0.05），提示pig7基因产物可促Kasumi-1细胞分化及凋亡，同时可增加其它白血病细胞对药物的敏感性。