基于启动子工程策略对大肠杆菌高效活性表达外源蛋白的动力学研究

The prokaryotic host, Escherichia coli, is considered a very successful system for heterogeneous proteins expression. However, there are still a lot of problems to be solved for this system to be extensively applied in the field of industrial enzymes, such as problems of inclusion body, low activity expression for some genes, and the limitation of knowledge about dynamics of soluble expression of heterogeneous proteins in E.coli. In this proposal, a random mutagenesis method based on promoter engineering strategy is designed to obtain a series of promoters with different transcriptional strength. These promoters will be used for certain heterogeneous proteins expression in E.coli, and a model of protein active expression dynamics describing the relationship between gene transcription level and enzymatic activity and inclusion body content will be constructed. Furthermore, the applicability and flexibility of this model will be tested on the scale of shaking flask and bioreactor, respectively. Some constitutive expression promotors are planed to be used to overexpress one or two industrially potential enzymes cost-effectively with the help of the promoter engineering strategy. The results obtained in this work are critical for better understanding the relationship between transcription, translation and folding of heterogeneous proteins expressed in E.coli, and could be a guideline for selection of proper promoters for the soluble expression of heterogeneous proteins in E.coli, and may impel a more extensive and successful application of the prokaryotic expression system of E.coli in the industry of enzymes and proteic pharmaceuticals.

大肠杆菌表达系统被广泛用于重组蛋白的表达，但存在着外源蛋白容易形成包涵体、活性表达不理想、缺少蛋白活性表达动力学研究等问题，限制了大肠杆菌表达系统在酶制剂等行业的应用。本课题根据启动子对基因转录与蛋白活性表达有重要影响的理论基础，采用启动子工程的方法，对启动子进行随机突变改造并筛选得到不同转录强度的启动子用于特定酶蛋白的表达，通过分析基因转录水平与活性表达蛋白及包涵体之间的定量关系进行大肠杆菌中蛋白活性表达动力学的研究，并进一步探讨该动力学模型在摇瓶水平及发酵罐规模等不同实验尺度下的适用性。在此模型指导下，选择合适的组成型表达启动子对1-2种具有重要应用价值的酶蛋白在大肠杆菌中实现高效活性表达。本研究可以为在大肠杆菌活性表达蛋白的研究中选择适宜的启动子提供理论依据，有效解决大肠杆菌表达蛋白中的包涵体问题，提高活性蛋白表达的效率，推动大肠杆菌表达系统在酶制剂和蛋白药物的工业中更广泛的应用。

大肠杆菌由于其具有生长迅速、培养条件简单及基因操作方法成熟等优点，已被广泛用于蛋白的重组表达，但大肠杆菌表达系统也存在着外源蛋白容易形成包涵体、活性表达不理想、缺少蛋白活性表达动力学研究等问题，限制了大肠杆菌表达系统在酶制剂等行业的应用。本课题旨在通过启动子工程的策略，提高大肠杆菌中外源蛋白活性表达的效率，并通过基因转录水平与活性表达蛋白及包涵体之间的定量关系进行大肠杆菌中蛋白活性表达动力学的研究。本课题首先建立了适用于启动子文库高通量筛选的方法，通过检测融合的绿色荧光蛋白的荧光在微孔板和流式细胞仪中对不同表达水平的突变菌进行筛选。接下来对不同类型的启动子进行了考察，构建了诱导型启动子T7和组成型启动子BBa-J23105的突变文库，分别进行了不同转录强度突变启动子的选择，考察了不同突变株的荧光强度、酶活、转录强度的关联性，并建立了相关动力学模型。研究发现强诱导型启动子T7在适当减弱转录强度时对异源蛋白的活性表达较为有利，而组成型启动子BBa-J23105在增强转录强度时对异源蛋白的活性表达有利。建立了基于启动子工程策略的大肠杆菌高活性表达外源蛋白的技术平台，对头孢菌素C酰化酶、腈水解酶、过氧化氢酶、氨基酸酯酰基转移酶等基因在大肠杆菌中进行了表达优化，其中头孢菌素C酰化酶的活性相比原始启动子提高了3.11倍，达到12.77 U/mL，氨基酸酰基转移酶活性相比原始株提高了1.94倍，达到44.03U/mL，可以满足工业酶催化生产对菌株酶活的要求。本课题的研究成果为在大肠杆菌活性表达蛋白的研究中选择适宜的启动子提供了一定的理论依据和实践参考，采用启动子工程策略可以有效解决大肠杆菌表达蛋白中的包涵体问题，提高活性蛋白表达的效率，推动大肠杆菌表达系统在酶制剂和蛋白药物的工业中更广泛的应用。