CARD9介导的信号通路与肠道真菌在克罗恩病发病机制中的研究

A recent Genome-wide association studies (GWAS) identified the non-synonymous single nucleotide polymorphism nsSNP rs4077515 in CARD9 is associated with Crohn's disease (CD).This SNP leads to an amino acid substitution from a serine to an asparagine residue,which maybe influenced CARD9 function. Caspase recruitment domain protein 9 (CARD9) plays an essential role in anti-fungus immunity.As an important adapter protein, CARD9 connects zymosan activation of Dectin/syk of signals to the BCL10-Malt1 complex, leading to NF-κB activation and the release of cytokines such as TNFα , IL10,etc.The host with this susceptibility locus is triggered an impaired immune response to the intestinal fungi. Anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA) which is a high degree of specificity of serological markers of CD, is another strong clues that intestinal fungi may be involved in CD pathogenesis. We aim to study CARD9-mediated antifungal immune signaling pathway and intestinal fungi in CD pathogenesis, and provide a new perspective on the study of CD pathogenesis.

全基因组关联研究（GWAS）报道CARD9基因的多态性与克罗恩病（CD）密切相关。CARD9 作为一个重要的衔接蛋白，连接真菌酵母多糖活化的Dectin/syk信号到BCL10-Malt1复合体，导致NF-κB激活，促进TNFα、IL10等细胞因子释放，参与抗真菌的天然免疫应答和获得性免疫应答。正常情况下，机体对肠道菌群处于免疫耐受状态,而携带该易感位点的个体，可能对肠腔内真菌免疫反应过强，导致肠道持续发生炎症反应。抗酿酒酵母菌抗体（ASCA）是 CD具有高度特异性的血清学标志物，提示肠道真菌可能和CD发病有关。本课题拟通过CARD9基因的变异将肠道真菌与CD发病联系起来，研究CARD9介导的抗真菌免疫的信号通路与肠道真菌在CD发病中的作用，从一个崭新的视角为CD发病机制的研究提供思路。

克罗恩病（CD）病因和发病机制至今尚不甚清楚，普遍观点认为携带遗传易感基因的个体在肠道菌群的作用下触发了异常的肠道免疫反应，从而导致本病。研究发现CARD9参与了真菌固有免疫，CARD9基因多态性与CD相关，而抗酿酒酵母菌抗体（Anti- saccharomycescerevisia antibody，ASCA）是CD第一个被发现的具有高度特异性的血清学标志物。本实验旨在初步探讨CARD9基因多态性、ASCA与中国CD患者相关性，从而预测CARD9介导的真菌免疫在CD发病中可能起一定的作用。研究内容及结果如下：（1）通过收集78例CD患者及103例健康志愿者血液，采用套式PCR重测序的方法检测两组人群CARD9（ rs4077515、rs10870077、rs10784099）基因型分布情况，研究发现CARD9基因多态性位点（rs4077515、rs10781499、rs10870077）的基因型频率在健康对照组和CD组中差异无统计学意义（p>0.05），但rs4077515位点的基因频率在健康组和CD组中比较P<0.05（OR 1.56，95%CI 1.0-2.4）。进一步在CD组分析CARD9基因多态性的分布情况，发现CARD9基因多态性位点rs4077515、rs10870077与CD疾病部位存在一定的相关性。（2） 通过检测其中63例CD患者及10例健康对照组血清抗酿酒酵母菌抗体（ASCA）、AYMA、AYCA、鞭毛蛋白抗体（CBirl）、I2(假单胞菌荧光相关性序列)、OMPC（大肠杆菌外膜蛋白C复合物抗体）、pANCA对CD诊断的临床价值。研究发现血清ASCA-IgG、CBirl、AYMA、AYCA、、I2、OMPC、pANCA敏感性低，但特异性高，不适合人群CD的筛查，但在CD鉴别诊断困难时可提供一定的参考依据。（3） 分离提纯并培养CD患者外周血PBMC，予以酿酒酵母菌刺激，采用荧光定量PCR检测CARD9、Dectin-1、Syk、IL-10、IL-2和TNFa6个基因的表达水平，与未加酿酒酵母刺激组比较无显著统计学差异。（4）收集提取CD、UC及健康对照粪便DNA，采用基于Miseq的ITS高通量测序方法进行三组人群粪便真菌菌群分析提示三组存在显著性差异。综上，我们的研究预示着肠道真菌及CARD9介导的真菌免疫在CD发病中可能起着一定的作用