Dvl蛋白交叉调控Wnt/β-catenin和NF-κB对炎性关节炎骨侵蚀的作用机制及研究

The previous three researches of ours supported by NSFC reveal that:The NF-κB and Wnt/β-catenin signal pathway play an important role in bone erosion induced by inflammatory arthritis. Recently,the Dishevelled(Dvl) has been recongized as the key point in the regulation of Wnt signal pathway,which stimulates the Wnt and upregulate the OB function,on the other hand,downregulate the OC due to inhibiting the NF-κB signal pathway.The strategies of present study are that:①To analyse regulating effect of Dvl on Wnt and NF-κB from gene and protein levels,aiming to demonstrate Dvl generate the dual function which upregulate Wnt pathway and represses NF-κB induced "inflammatory cascade".②To construct the siRNA and transfect it into C2C12 and preosteoclast in order to elucidate the mechanism of Dvl interference between the differentation of osteoblast and reconstruction of osteoclast by canonical Wnt3A signal pathway.③To demonstrate the Dvl goading the expression of β-catenin which inhibite the NF-κB activation through cooperating with P65 in TNFαtransgenomic arthritic murine model.The physiological function of Dvl maintain the homeostasis of bone metabolism which protect the OB and repress the OC by regulation of dual signal pathway，we are striving to clarify the function and mechanism of Dvl on the bone erosion of arthritic murine.The present study elucidate the function and mechanism of Dvl in Wnt/NF-κB signal pathway which held up the basic ponits to develop a new treatment strategies on bone erosion.

我们立足前期3项国家自然科学基金研究提示：Wnt/β-catenin和NF-κB是炎性关节炎骨侵蚀关键信号通路，Dishevelled（Dvl）具有活化Wnt通路，抑制NF-κB炎症效应、加强成骨同时抑制破骨，维持骨代谢稳态。本研究拟开展：①从基因和蛋白层面观察Dvl激活Wnt信号通路，上调成骨活性；同时抑制NF-κB介导的"炎症因子风暴"，调控骨代谢。②构建siRNA，转染C2C12细胞和破骨前体细胞，揭示成骨和破骨细胞调控机制，探究Dvl通过经典Wnt3A途径调控破骨细胞分化和骨重建机制，③在TNFα转基因关节炎小鼠，验证Dvl诱导关节β-catenin表达，协同P65抑制NF-κB活性，通过上调OB和抑制OC，维持关节骨代谢稳态，力图揭示Dvl在炎性关节炎小鼠骨侵蚀作用及其机制。本研究不仅阐明Dvl功能和调控机制，而且为研究Wnt/NF-κB双通道药物靶点增添新武器。

类风湿关节炎(RA)是风湿科常见的一种疾病，也是致残率比较高的一种疾病，严重影响着患者的生活质量和预期寿命。RA的主要病理改变是滑膜炎和骨侵蚀，NF-κB通路是上述病理过程最为重要的信号通路，而Wnt通路也是近年来研究比较多的一条信号通路，它是调控细胞增殖、分化、自我更新、生长及稳态的重要通路。我们前期3项国家自然科学基金研究提示Wnt/β-catenin和NF-κB是RA滑膜炎和骨侵蚀关键信号通路。Dishevelled (DVL) 是WNT信号通路中重要的蛋白，是经典Wnt通路和非经典Wnt通路的十字路口。DVL除了连接经典和非经典Wnt通路，还可以与其他几十种蛋白相互作用。本课题便是探讨DVL是否能够与NF-κB通路中的一些重要蛋白发生相互作用进而连接Wnt和NF-κB这两条RA中重要的信号通路。.一、为了探讨DVL在成骨和破骨细胞中是否具有连接Wnt和NF-κB信号通路的作用并参与RA的骨侵蚀，我们选取C2C12细胞系和RAW264.7细胞系作为研究对象，通过上调和下调Dvl2的基因表达，检测Wnt和NF-κB信号通路活性及主要调控蛋白表达量的变化。实验结果显示Dvl2对C2C12细胞增殖无影响，和Wnt3a可促进C2C12细胞OPG的分泌，且Dvl2上调OPG分泌的能力高于Wnt3a；同时可下调RANKL蛋白表达量。在RAW264.7细胞中Dvl2可与P65结合抑制RAW264.7细胞κB-Luc报告基因活性，下调相关靶基因IκB-α蛋白的表达。.二、为了探讨DVL对是否能够通过交叉调控Wnt和NF-κB信号通路从而参与RA滑膜增殖及炎症因子的分泌，我们通过临床滑膜标本的采集、原代细胞的培养、动物体内实验、体外细胞实验以及基因层次的改造，系统的研究了DVL2在RA患者关节滑膜中的表达情况以及在体内体外对RA-FLS增殖及炎症因子分泌的影响。结果发现虽然DVL2在RA滑膜中处于高表达状态，但是DVL2也可以促进RA-FLS凋亡并抑制其炎症因子的分泌。可能的作用机制可能是其一方面是Wnt信号通路中重要的正向调控蛋白，另一方面DVL2还可以与P65的相互作用来抑制NF-κB通路，从而起到一定的炎症抑制作用。. 总之，本研究证明了DVL在成骨细胞、破骨细胞以及滑膜的成纤维样滑膜细胞中均可通过交叉调控Wnt和NF-κB信号通路而参与RA的滑膜炎和骨侵蚀。