预防断奶仔猪F4+ ETEC腹泻的双靶向修饰乳酸杆菌活载体疫苗的免疫机制

采用细胞互作模型、离体实验等方法筛选对DC、M细胞均具有靶向结合功能的修饰性增强型绿色荧光蛋白（EGFP）模式分子，并分析在此过程中对抗原的摄取转运效率、对DC成熟、功能的影响。用LTB-linker-FaeG-STa表位融合蛋白作为F4+ ETEC的保护性抗原置换优选的最佳双靶向修饰模式分子中的EGFP，构建表达F4+ ETEC保护性抗原的DC、M细胞双靶向修饰的乳酸杆菌活载体疫苗。通过动物实验验证该疫苗对哺乳仔猪肠道发育、非特异性免疫功能的影响，检测并比较分析所诱导产生的免疫应答的特征以及攻毒后病理学变化、抗感染能力等系列指标。从乳酸杆菌调理肠道功能以及双靶向传递抗原的角度，阐明促进哺乳仔猪产生更早、更快、更强免疫应答的机制，为F4+ ETEC断奶仔猪腹泻等疾病的早期免疫预防提供新思路和理论依据。

利用动物模型，筛选到对DC、M细胞具有双靶向作用的分子，证实乳酸菌活载体疫苗表达的抗原经过DC、M细胞双靶向修饰后抗原转运效率可明显提高、诱导产生的免疫应答得到进一步增强。研究发现：（1）构建的ETEC 多价融合抗原基因FaeG-STa-LTB-STb在大肠杆菌中获得了高效表达，主要以包涵体形式存在；Western blot证实融合蛋白具有良好的反应原性。以小鼠为模型的动物实验结果表明，目的蛋白安全、无毒性，可诱导动物产生针对各个蛋白的抗体，诱导产生局部黏膜免疫应答、体液免疫和细胞免疫应答，并可有效抵抗细菌的攻击，是适合用于基因工程疫苗研究的基因片段。（2）证实LTB、LTAK63、LTAK63和 LTB 蛋白共表达蛋白均可在乳酸菌活载体疫苗中被用作佐剂。不同形式表达的LTB蛋白和LTAK63蛋白对提高小鼠血清中特异性IgG水平和黏膜sIgA水平均有一定的作用，且LTAK63蛋白和LTB蛋白共表达后呈现出的佐剂活性高于融合表达；对小鼠的体液免疫应答和细胞免疫应答均起到了一定的增强作用，说明构建的重组菌呈现出了一定的黏膜佐剂活性，为新型黏膜佐剂的研究奠定了基础。（3）M细胞靶向肽能够对抗原能够产生免疫增强作用。M细胞靶向修饰的重组菌具有良好的免疫效果，无论在诱导动物产生体液免疫应答、刺激粘膜免疫系统产生sIgA抗体，还是抵抗ETEC的感染方面均优于未修饰组。（4）靶向分子CPE17、CPE30、C5aL、YadA、FimH均可提高经黏膜免疫的效果，双靶向分子CPE17-DCpep、CPE30-DCpep、C5aL-DCpep、YadA-DCpep、FimH-DCpep可进一步提高免疫效果，其中以YadA、YadA-DCpep组合效果最为明显，可显著提高抗体水平，缩短免疫应答的时间。（5）密码子优化合成的FaeG--STa-LTB-STb可显著提高表达量。（6）口服免疫哺乳仔猪两次即可诱导产生保护性反应，与对照组相比，日增重明显提高，至少可以抵抗1011CFU ETEC攻击。.共发表文章4篇（含录用2篇），SCI收录1篇；申请国家发明专利3项，授权1项，培养研究生5人。