质子泵在微藻油脂代谢过程中的分子机制研究

Currently, the research on microalgae lipid engineering is focused on the molecular mechanism of lipid synthesis, generation of new types of engineering microalgae, and controls on the lipid metabolism flow. However, the role of proton pump in microalgae, especially in the regulation of lipid synthesis, is not clear. The previous study has revealed that microalgae cultures in alkalinous media could induce the lipid accumulation, which was found in Phaeodactylum tricornutum and Chlorella vulgaris. In addition, proton pump seems to function in lipid synthesis and generation of oil bodies. This project use the proton pump and P. tricornutum as the main subjects. The objectives are to (i) through determination of the activity and gene expression of proton pump induced by alkalinous conditions, analyze the dynamic activity and expression of proton pump during the process of lipid accumulation; (ii) by RNA-seq analysis of microalgae transcription level under the inhibition of proton pump activity, analyze the function of proton pump in response to alkalinous conditions; (iii) according to the reference genome of lipid accumulation, analyze the link between proton pump and lipid accumulation; (iv) by means of real time PCR, further verify the molecular mechanism of lipid accumulation regulated by proton pump. As a perspective of foundational study, this research provides a new insight into the role of proton pump in microalgal lipid metabolism, and also promotes the generation of high quality biodiesel-producing microalgae.

从分子水平揭示油脂合成及调控的机理，改良藻种，控制油脂代谢流向，是当今微藻油脂工程的研究热点。目前有关质子泵在微藻中，特别是在油脂代谢中的作用机制知之甚少。前期的研究发现，碱性pH值可以诱导三角褐指藻和小球藻中的中性脂肪酸含量显著增加，并且质子泵可能在油脂的合成及油质体形成中发挥重要作用。本项目拟在此基础上, 以质子泵和三角褐指藻为主要研究对象：①通过测定碱性pH值诱导下的质子泵活力和油脂含量，分析质子泵在油脂合成中的动态曲线；②根据添加质子泵抑制剂前后转录水平的差异，分析质子泵在pH诱导下参与调控的理化过程；③结合油脂代谢基因组学的相关知识，分析质子泵与油脂合成之间的关联；④通过定量PCR进一步验证质子泵调控油脂代谢的分子机制。作为前瞻性的基础研究，本项目将为深入探究质子泵在微藻油脂代谢中的分子机制，以及科学评价质子泵在油脂代谢中的功能提供理论依据，并为优质产油藻株的构建提供实验基础。

本研究以pH值、质子泵和三角褐指藻油脂代谢为主要研究对象，研究了质子泵对微藻生长生理以及油脂积累的影响，并在此基础上，进一步探讨了质子泵调控微藻生长生理以及油脂代谢的分子机理。研究方法包括血球计数板检测，荧光显微镜检测，激光共聚焦检测，流式细胞仪检测，电镜检测，GC-MS检测以及RNA-seq技术。研究发现在微藻的整个生长周期中，培养液的pH值是波动的，在生长第3天左右pH值达到峰值，继而缓慢下降，最后pH值稳定在9.5左右。而微藻油脂的大量积累开始于微藻生长进入平台期即第6天之后。不同pH值对微藻生长以及油脂含量的检测显示，碱性pH值能诱导微藻油脂的积累，进一步对微藻胞内pH值的测定显示，碱性pH的处理诱导了胞内pH值的上升，而对氮磷含量的测定显示碱性pH值加速了微藻对氮元素的消耗，但并有明显影响磷代谢能力。RNA-seq技术显示碱性pH值处理加速了氮代谢途径基因的表达，此外，糖酵解途径和TCA循环的基因也有明显的上调，调控光合途径的基因略微下降。但油脂合成途径中关键的基因却没有明显的变化。碱性pH值诱导微藻油脂的积累可能是通过改变微藻细胞中碳流的流向来实现的。此外，我们也深入探讨了质膜质子泵（简称PM-ATPase）以及囊泡型质子泵(简称V-ATPase)对微藻油脂积累的影响。实验结果表明两种质子泵抑制剂的添加并没有显著改变微藻细胞的生长，电镜和共聚焦的结果显示两种质子泵抑制剂的添加显著的降低了微藻中油脂体的数目以及大小。GC-MS的结果显示V-ATPase抑制剂的添加并没有明显改变微藻细胞油脂的组分，而PM-ATPase抑制剂的添加显著的降低了微藻细胞中不饱和脂肪酸的含量。RNA-seq的技术显示V-ATPase抑制剂的添加显著的降低微藻细胞氨基酸代谢途径，油脂合成，糖酵解以及TCA循环中基因的表达，而与光合相关的基因表达略微上升。而PM-ATPase抑制剂的添加显著上调了糖酵解途径和部分脂肪酸和氨基酸代谢的基因，而TCA循环以及光合相关的基因没有明显的变化。虽然如此，但前后期的添加质子泵的抑制剂却导致了不同基因的表达谱产生。本次课题研究的结果从细胞和分子水平对质子泵在微藻油脂代谢的机理有了较为全面的认识，对高效能的微藻油脂工程藻株的建立提供了理论基础；后续的研究将会在蛋白水平上进一步揭示质子泵在微藻油脂合成的功能，以延续和完善研究的内容。