侵袭转移相关新分子NEDD9在介导肝癌干细胞侵袭转移中的作用及分子机制研究

肝癌的复发转移是大多数肝癌患者死亡的重要原因，而肿瘤干细胞在其中发挥着重要作用。我们课题组借助荧光激活的流式细胞分选干细胞技术，成功地从原发性肝癌组织中分离得到了具有成瘤性、自增殖、克隆形成等特性的肝癌干细胞亚群，证实其与肝癌的侵袭、转移及耐药密切相关；利用基因芯片技术获得了差异相关基因NEDD9，并初步证实其与干细胞样肝癌细胞的转移相关，但具体作用机制不明。本课题拟通过免疫组化等方法大样本检测NEDD9在肝癌组织中的表达，评价其与肿瘤转移的关系；利用基因转染、RNA干扰等技术从体内、外观察上调或下调NEDD9的表达水平对肿瘤干细胞侵袭和转移能力的影响，评价其作为肝癌治疗靶点的意义；利用蛋白质相互作用研究方法，探讨NEDD9介导肝癌侵袭及转移的信号转导通路，从分子水平阐明NEDD9在介导肝癌转移中的可能机制。为阐明肝癌侵袭转移的分子机制、调控网络和寻找新的治疗靶点提供理论和实践基础。

本课题组首先收集200例肝癌患者的手术切除标本，以免疫组化检测证实NEDD9在肝癌中的表达明显高于癌旁组织，且随着TNM分期的进展，NEDD9蛋白表达逐渐增强。统计分析表明，NEDD9蛋白表达升高与较高的临床TNM分期、低分化及门静脉癌栓形成有关。生存分析表明，随着NEDD9表达强度的增高，肝癌患者的生存时间显著缩短，两者呈负相关关系。这些结果均提示，NEDD9的表达与肝癌的临床恶性进展有密切关系。接下来，课题组包装了NEDD9过表达和基因沉默质粒的慢病毒，以MHCC97H 和Li-7细胞为实验对象，建立NEDD9过表达和基因沉默的细胞系。细胞划痕修复实验、Transwell实验和细胞黏附实验证实，下调肝癌细胞中NEDD9表达，可明显抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和黏附能力。裸鼠成瘤实验发现上调NEDD9表达明显增强肝癌细胞的体内转移能力，肝癌肺转移率显著增高。这些结果均提示NEDD9在肝癌细胞粘附侵袭中发挥重要作用，过表达可促进细胞转移，抑制可降低移行能力，但其在肝癌细胞侵袭中的机制不清楚。为了回答这个问题，我们首先利用Hoechst3342成功地在高转移MHCC-97和Li-7肝癌细胞系中检测并分选到边缘群细胞（肝癌干细胞），而后检测了侧群（肝癌干细胞）和主群细胞中NEDD9和P-SMAD7的表达情况，我们发现两种肝癌侧群细胞中NEDD9的表达高于主群细胞，而P-SMAD7则表现出了相反的表达情况。利用悬浮细胞模拟肝癌干细胞，我们进一步发现悬浮细胞中NEDD9表达升高，SMAD7活性降低；而下调和上调MEDD9的表达，可反向调节SMAD7的表达；此外，下调NEDD9或者上调SMAD7的表达抑制了肝癌干细胞的克隆形成能力。将myc-NEDD9质粒转染入肝癌干细胞，以NEDD9作为诱饵蛋白，进行免疫共沉淀检测，发现肝癌干细胞中NEDD9可与FAK、Src和Crk直接结合。目前正采用免疫共沉淀结合质谱技术筛选肝癌干细胞中与NEDD9相互作用的新分子。总之，本课题首先证实NEDD9 的高表达与肝癌的恶性生物学进展密切相关，可促进肝癌细胞的迁移、侵袭和黏附能力；肝癌干细胞中NEDD9呈高表达趋势，与肝癌干细胞的克隆形成能力有关，而SMAD7是其下游调控分子。项目研究基本按计划进行，紧跟国际前沿进行了局部相应调整。