致耐受性Exosome联合Treg细胞诱导移植免疫耐受及其机制研究

The hotspots in organ translantation is the investigation of strategies in induing and maintaining inmmune tolerance through immature dentritic cells and regulatory cells. However, imDCs can only be stored for a short time in vitro and can be easily activated into mature DCs onceinjected into the body. Besides, the proliferation and activation of Treg depends on regulation of imDCs. These greatly restricts theirclinical use. Recently, some studies have reported that DCs can secret Exosome, which is a microcystin-structure of the membranous, contains the exogenous antigen presented by the DCs and expresses major histocompatibility complex (MHC) and costimulatory molecules. As the DC-derived exosome (Dex) is stable and can be easily stored and used in clinic, it can be a substitution of DCs in inducing the immune tolerance. Our preliminary studies, together with some other experiments, have demonstrated that exosomes from donor imDCs (imDex) can prolong the graft survival time in murine models of heart and small intestine transplantation, andthis ability is closely related to the interaction of imDCs and recipient CD4+CD25+ T cells. In order to overcomethe limitions and improvethe effect of immunosuppression of imDCs and Treg, we intend to observe the effect of immune tolerance induced bythe donor imDex in combination with the Treg in rodent heart and liver transplantation model, and make the indoleamine-2,3-dioxygenase as the core melecular to explore the mechanisms of immune tolerance. Our study is expected to provide successful experiences and possible options for clinical transplantation immune tolerance.

以未成熟树突状细胞（imDC）和CD4+CD25+Foxp3+ 调节性T细胞（Treg）为主的免疫调节策略是目前移植免疫的研究热点。但前者保存时间短，体内易被激活成熟，而后者增殖活化又依赖前者调控，因而临床应用受限。目前发现DC可分泌膜性微囊体-Exosome，其表面富含相关免疫分子，并内含DC所提呈的外源性抗原，且性质稳定，可长期保存。文献报道和我们前期研究表明，供体imDC来源的Exosome（imDex）可延长鼠类心脏和小肠移植物的存活时间，但需联合小剂量免疫抑制药物才能诱导出理想的耐受状态，且该效果与体内CD4+CD25+ T细胞比例有密切关系。为解决上述临床应用受限及诱导耐受效果弱等问题，本课题拟在鼠类心脏和肝脏移植模型中，观察供体imDex与Treg单独及联合应用诱导免疫耐受的效果，并以吲哚胺-2,3-双加氧酶为核心，探讨两者相互作用及诱导耐受的机制，为防治免疫排斥提供新思路。

如何减少和避免肝移植术后免疫抑制剂的应用，是肝脏移植研究领域的重要方向。目前公认的具有免疫调控能力的细胞是未成熟树突状细胞（imDC），但其受限于保存时间短，体内易被激活成熟，因而治疗性研究受到限制。前期研究中，课题组利用供体imDC来源的Exosome（imDex）在一定程度上延长小鼠心脏移植物的存活时间，但需联合小剂量免疫抑制药物才能诱导出理想的耐受状态，且该保护效果与体内Treg 比例有密切关系。为解决上述临床应用受限及诱导耐受效果弱等问题，我们以BN/F344大鼠为供体，Lewis大鼠为受体，构建了近交系大鼠异基因原位肝脏移植模型。利用超高速梯度离心法自供体骨髓来源的未成熟树突状细胞（imDCs）的培养上清中获得供体imDex。电子显微镜和流式细胞术证实分选出的imDex很好的保持了imDC的表型，其保护移植肝脏的最佳作用剂量为20μg。而后利用两步免疫磁珠分选技术分选受体脾脏来源CD4+CD25+ T细胞，并与供体抗原提呈细胞共培养，获得供体抗原预刺激的Treg。体内外实验表明，输注供体抗原特异性Treg对移植物的保护作用显著高于单纯磁珠分选后的自然Treg（P<0.05）。两者联合应用组的受体生存时间显著优于对照组（P<0.01），联合应用组受体移植肝术后第10d和第40d免疫排斥反应轻微，体内T细胞增殖活性及其细胞因子分泌均减低。外源性输注的Treg体内出现显著增殖，并且在受体移植物、脾脏、外周血中均有分布。进一步体外实验中发现imDex可以扩增Treg，而体内Treg的检测表明，imDex联合处理组Treg增殖显著高于单纯的外源性Treg处理组，验证了体外的实验结果。本项目的研究首次证实，联合输注供体来源imDex和供体抗原特异性Treg，可在大鼠同种异基因肝移植模型中诱导出稳定的免疫耐受状态，显著延长移植物和受体的存活时间。同时还发现imDex在受体体内外扩增Treg细胞可能是两者联合应用发挥协同效果的机制。本项目研究为移植术后应用致耐受Exosome 和Treg 细胞诱导移植免疫耐受的思路提供理论支持和实验证据，并为临床诱导移植免疫耐受提供了成功经验和有潜在应用价值的方案。