富含Galectin基因修饰的MSC脱细胞真皮基质补片移植治疗大鼠肛门外括约肌损伤

Galectin-1是一种新的促骨骼肌再生和修复因子。我们前期研究证实：骨髓间充质干细胞（MSC）移植可增加受损的大鼠肛门外括约肌收缩能力、减少外括约肌修补处瘢痕形成。本项目将以研究Galectin-1调控MSC向骨骼肌分化为突破点，采用质粒构建转染技术、荧光显微镜技术、Real-time PCR、Western Blot等技术，将构建的pEGFP-N1-Galectin-1质粒转染大鼠MSC细胞、与人脱细胞真皮基质材料共培养制作成生物补片，通过大鼠肛门外括约肌损伤模型观察生物补片移植对肛门外括约肌损伤的治疗作用，探讨Galectin诱导MSC向骨骼肌分化以及将脱细胞真皮基质作为MSC移植载体的可行性，以期为临床应用提供一定的依据。

目的 探讨富含Galectin基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSC）的脱细胞真皮基质(ADM)补片移植修复大鼠肛门外括约肌损伤的可行性。方法（1）取Wistar大鼠，分离培养MSC，流式细胞仪检测MSC表面标志鉴定MSC；（2）构建重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-Galectin-1；（3）pAdxsi-GFP-Galectin-1转染大鼠骨髓MSC后，通过ELISA以及Western blot检测Galectin-1及Desmin表达；（4）pAdxsi-GFP-Galectin-1转染的大鼠MSC与人ADM补片体外共培养研究：MTT法观察MSC在ADM材料中的生长情况；（5）取Wistar大鼠40只，分成A、B、C、D四组，制成肛门括约肌损伤模型。2周后，将富含Galectin基因修饰的MSC的ADM补片移植于大鼠肛门外括约肌损伤处。A组行端端缝合修补，B组端端缝合加修补处覆盖ADM补片，C组端端缝合加修补处覆盖富含MSC的ADM补片，D组端端缝合加修补处覆盖富含Galectin基因修饰的MSC的ADM补片。6周后移除包括肛管及下端直肠在内的环形标本，行HE和Masson染色观察组织形态学改变，直肠肛管测压评估肛门括约肌功能。 结果（1）大鼠MSC培养及表面抗原鉴定：CD90呈阳性表达，阳性率为98.1%，CD45表达率为3.2%；（2）通过酶切鉴定和基因测序证实重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-Galectin-1 构建成功；（3）质粒转染大鼠骨髓MSC 后72小时荧光显微镜下绿色荧光达峰值，细胞培养上清中Galectin-1的分泌量显著高于腺病毒空载体转染MSC组，Desmin的蛋白表达升高；（4）体外共培养结果显示： pAdxsi-GFP-Galectin-1质粒转染MSC在前四天增殖旺盛，共聚焦荧光显微镜下观察MSC与ADM融合生长良好，第四天达高峰，后趋于平稳，证明人ADM材料是MSC的良好载体；（5）HE和Masson染色结果显示：与A、B、C 组相比， D组大鼠损伤肛门括约肌修复处胶原纤维沉积显著减少，血管新生增加及肌纤维增多；肛门外括约肌收缩压力检测，D组显著高于其它各组。 结论 ADM补片是MSC移植的良好载体；Galectin-1能诱导MSC向肌肉分化；富含Galectin-1基因修饰MSC的ADM补片对大鼠损伤EAS具有良好的修复作用。