华支睾吸虫的病原相关分子模式的识别及其诱导NO产生机制的研究

Clonorchis sinensis (C. sinensis) infections are characterizes by prominent NO production and elevated endogenous nitrosation. These processes are closely related to the development of cholangiocarcinoma. The pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) combine with pattern recognition receptors (PRRs), such as the Toll-like receptors (TLRs), and activate downstream signal transduction pathways, induce iNOS/NO and cytokines production. On the basis of previous studies of the identities and modes of action for traditional PAMPs from bacteria, fungi and viruses, we will determine the molecules, such as glycolipids, glycoprotein and their oligosaccharides and lipids components from C. sinensis, which responsible for TLR2 and/or TLR4-mediated intracellular signal activation, in this project. The differences in binding modes with TLRs, signal transduction pathways and effects between PAMPs from C. sinensis and traditional PAMPs such as Zymosan and LPS will also be considered. After clarifying the characters of PAMPs from C. sinensis, we will further study the mechanisms of iNOS/NO and pro-inflammatory cytokine expressions following TLR signal activation induced by PAMPs in sensitive target cells. The findings of this study will help to discover the mechanisms of imunopathogenesis and carcinogenic effects during C. sinensis infection.

华支睾吸虫感染后伴随机体NO产生和内源性亚硝基化作用增加，其过程与胆管癌发生密切相关。病原生物的病原相关分子模式（PAMPs）通过与Toll样受体（TLR）等模式识别受体（PRR）结合，活化下游信号转导途径，诱导iNOS/NO和细胞因子反应。在对细菌、真菌和病毒等传统病原生物PAMPs的本质和作用模式研究和认识的基础上，本项目以来源于华支睾吸虫的糖脂、糖蛋白及其中脂质和寡糖等组分作为研究对象，研究其活化TLR2和/或TLR4信号的作用以及在辅助分子、信号转导途径和效应等方面与Zymosan和LPS等传统PAMPs的差异。在阐明华支睾吸虫PAMPs的本质和作用特点基础上，进一步研究华支睾吸虫PAMPs活化TLR信号直接诱导敏感靶细胞iNOS/NO表达以及通过诱导促炎症反应细胞因子产生间接促进其表达的过程和机制。研究结果将有助于深入认识华支睾吸虫免疫病理反应发生以及致癌机理。

华支睾吸虫感染伴随体内亚硝化过程增强，并与胆管癌发生密切相关。本项目研究目的是探索华支睾吸虫感染后可诱导的一氧化氮合成酶（iNOS）/NO反应及其机制，了解华支睾吸虫病原相关分子模式（PAMPs）及在NO反应中的作用。实验首先收集华支睾吸虫囊蚴并感染BALB/c小鼠，研究华支睾吸虫感染后肝胆管局部和脾脏组织iNOS和相关细胞因子的表达动态；其次，将华支睾吸虫囊蚴感染TLR2基因突变型C57BL/6J小鼠，研究TLR2信号在成虫发育、iNOS/NO反应中的作用；然后，用高效薄层色谱（HPTLC）分离华支睾吸虫排泄-分泌产物（ESPs）、虫体和虫卵的不同极性的生物大分子组分；并用分离到的组分刺激小鼠巨噬细胞系Raw264.7，研究其PAMPs活性及对iNOS/NO表达的影响和相关机理。实验的主要结果是：. 1、用针对华支睾吸虫线粒体COX1基因和rDNA ITS1/ITS2区的特异性引物的PCR法可鉴别华支睾吸虫囊蚴，其灵敏性和特异性优于ITS1/ITS2区通用引物。.2、华支睾吸虫感染小鼠后出现胆管周围炎细胞侵润并伴有肝胆管增生和纤维化；重度感染可引起急性肝实质大范围点状坏死；肝胆管组织iNOS表达出现在中度和重度感染时，且iNOS表达细胞类型多样。.3、华支睾吸虫感染可诱导小鼠脾脏iNOS表达，与感染程度呈正相关，随感染时间延长逐渐增强；iNOS表达细胞集中在红髓，以被膜下最为集中。.4、华支睾吸虫感染后期脾细胞IFN-γ、IL-12和IL-18等转录受抑制，与iNOS表达无必然联系。.5、TLR2基因突变有助于华支睾吸虫在C57BL/6J小鼠肝胆管的发育，且对于感染早、中期iNOS/NO产生有促进作用，感染后期则表现为抑制效应。.6、华支睾吸虫ESPs、虫卵和虫体来源的水溶性组分中包含系列弱极性成分。.7、分离到的弱极性组分能刺激Raw264.7细胞，活化 NF-κB，同时促进NO产生。.综合研究结果认为：华支睾吸虫感染可诱发肝胆管局部和脾脏iNOS表达，其表达不归因于Th1反应；TLR2信号在iNOS/NO反应中表现为负向作用。华支睾吸虫ESPs水溶性弱极性组分中包含具有PAMPs活性的生物大分子，它们通过刺激敏感靶细胞活化NF-κB；同时，其中也包含具有抑制iNOS/NO活性的成分，它们与PAMPs共同参与华支睾吸虫感染后的免疫病理和耐受过程。