EF4(LepA)蛋白的分子伴侣活性及其与翻译过程的内在关系

The ribosome is the factory of protein biosynthesis in cell. Genetic information carried on an mRNA is translated here into a polypeptide, which will fold into functional protein with higher structural conformation. During translation, the ribosome is moving along an mRNA in the direction 5' to 3'. Our early study reported that such movement is reversible. The enzyme triggers the back-movement of the ribosome is called LepA, which we named EF4 after characterization of the protein. Molecular chaperone is a large protein family facilitating protein folding, protecting protein from unfolding stress. Recently, we found EF4 possessing chaperone activity. Through this project, we plan to study the chaperone characters of EF4 by checking its ability to facilitate protein refolding, protect protein from aggregation etc.. On the base of that, we hope to find the substrate of EF4's chaperone activity and the intrinsic relationship of it with the translation machinery.

核糖体是蛋白质的生物合成工厂，遗传信息在这里被翻译成具有一定氨基酸序列的肽链，其再经过高级结构的折叠，形成具有生物活性的蛋白质。核糖体在信使RNA（mRNA）上沿着5'至3'的方向移动。我们前期的工作发现，该运动是可逆的，催化逆向运动的因子叫做LepA，后称为EF4。分子伴侣是一类帮助蛋白质正确折叠的蛋白质，帮助新生肽链或变性蛋白质形成正确的构象。最近，我们的实验结果表明EF4蛋白具有一定的分子伴侣活性。通过本项目，我们计划研究EF4蛋白的分子伴侣活性，从其对多种变性蛋白的复性、抑制聚集作用，以及核苷酸和核糖体对其分子伴侣活性的影响等方面深入研究其分子伴侣活性的特点。并在此基础上，找到EF4分子伴侣活性的底物，阐明酶（分子伴侣）和底物间的关系， 及其对翻译机器整体的影响。

翻译相关的GTP酶 (trGTPase) 在核糖体上调节蛋白合成的所有过程。trGTPase被招募到核糖体过程中，首先是通过GTP酶的结构域G与核糖体蛋白L12-CTD相互作用，接着L12-CTD与L11-NTD结合。通过突变相互作用位点的保守氨基酸，功能实验结果表明，它们在trGTPase结合到核糖体过程中起重要功能。在结合时，L11-NTD的loop62插入到L12-CTD形成的狭缝中，导致后者形成打开的构象并暴露出核心疏水区。L12-CTD此时的构象极不稳定，很容易回到原来状态，EF-G结构域G的分子伴侣活性则能稳定L12-CTD的这种构象，并保护与L11-NTD间的相互作用。我们的结果表明，所有的trGTPase，无论它们在蛋白翻译过程中的哪一步中发挥功能，都是利用一种普遍的机制来稳定L11-NTD和L12-CTD间的相互作用，据此，我们将这种模型称为“支持并保护”理论模型。.EF-G在核糖体再循环过程中的作用。在核糖体再循环过程中，EF-G通过稳定核糖体的旋转状态并与RRF相互作用从而将核糖体的大小亚基分开，让核糖体进入循环再利用。我们的研究显示在tRNA移位的过程中发挥关键作用的EF-G的结构域IV的第二个Loop，在核糖体体再循环中也起到重要作用。进一步的生化实验结果显示Loop II直接参与到打开核糖体大小亚基之间的亚基桥B2a。所以这些实验结果完善了核糖体再循环机制，证明EF-G在核糖体再循环过程中不仅可以协助RRF将核糖体的大小亚基分开，EF-G蛋白自身通过与B2a相互作用直接参与到核糖体再循环过程。研究EF4催化tRNA在核糖体中反向移位的作用，根据结构信息，结合生化实验阐述其发挥作用的机制。电镜结构中得到的分辨率为3.7Å和3.2Å的两个核糖体复合物结构。实验结果显示EF4的CTD深入到核糖体肽酰转移酶中心，并与P位点tRNA直接相互作用，对这些作用位点进行突变，EF4的催化tRNA逆向转运的功能就会受到抑制，证明EF4破坏tRNA与核糖体PTC的P-loop之间形成的氢键是其发挥催化所必需的。在氢键破坏之后，EF4又可以稳定tRNA与核糖体A位点的相互作用，这让P位点的tRNA能够移动到A位点并稳定在A位点。这些发现有利于我们对核糖体蛋白质翻译机制的深入的了解。